Il primo corpo polare può essere usato per la produzione di prole normale nel topo1

Abstract

Lo scopo di questo studio era di determinare se i cromosomi nel primo corpo polare possono partecipare al normale sviluppo embrionale. Nel topo la maggior parte dei primi corpi polari degenera subito dopo l’ovulazione, ma alcuni rimangono vitali per 10 ore o più. Quando il contenuto di un corpo polare vivo è stato iniettato in un ovocita maturo enucleato ed esaminato 2 ore dopo, i cromosomi del corpo polare erano disposti su una piastra di metafase come si vede prima della divisione meiotica secondaria. Tali ovociti sono stati fecondati normalmente dall’iniezione di sperma. Quando gli embrioni a 2 cellule sono stati trasferiti a femmine adottive, il 30-57% si è sviluppato in prole fertile. Questo risultato supporta una convinzione di lunga data che i cromosomi espulsi nel primo corpo polare hanno lo stesso potenziale genetico di quelli rimasti nell’ovocita dopo la prima divisione meiotica. Poiché i cromosomi nel secondo corpo polare sono noti per avere il pieno potenziale per partecipare al normale sviluppo embrionale, è teoricamente possibile riprodurre quattro figli utilizzando i cromosomi in un solo ovocita.

Introduzione

L’ovocita primario dei mammiferi emette il primo corpo polare prima dell’ovulazione. Il secondo corpo polare viene estruso dall’ovocita come conseguenza dell’attivazione dell’ovocita innescata dallo spermatozoo fertilizzante. Normalmente, i cromosomi all’interno del primo e del secondo corpo polare degenerano senza contribuire allo sviluppo embrionale. La speculazione che i cromosomi del corpo polare hanno lo stesso potenziale genetico dei loro cromosomi fratelli che rimangono nell’ovocita è stata dimostrata sperimentalmente da Wakayama et al. e Feng e Hall, che hanno ottenuto prole di topo viva fondendo i secondi corpi polari con uova fecondate dalle quali erano stati rimossi i pronuclei femminili. Qui riportiamo che i cromosomi del primo corpo polare sono anche in grado di partecipare al normale sviluppo embrionale se si permette loro di completare la seconda divisione meiotica all’interno di un ovocita enucleato, quindi si permette di mescolarsi con i cromosomi di uno spermatozoo iniettato.

Materiali e metodi

Animali

Topi femmina B6D2F1 (neri), di 8-10 settimane, sono stati usati come donatori di ovociti e corpi polari. Le femmine C3H (agouti; 10 settimane di età) e le femmine CD1 (albine; 10-15 settimane di età) sono state utilizzate anche come donatrici di corpi polari. Gli spermatozoi sono stati raccolti da epididimi caudali di maschi B6D2F1 di 10 settimane. Le madri affidatarie erano femmine CD1. Gli animali utilizzati in questo studio sono stati mantenuti in conformità con le linee guida del Laboratory Animal Service presso l’Università delle Hawaii e con quelli preparati dal Comitato per la cura e l’uso di animali da laboratorio dell’Istituto di risorse di laboratorio Consiglio Nazionale delle Ricerche (DHEW pubblicazione n. 80-23, rivisto nel 1985). Il protocollo della nostra manipolazione degli animali e dei trattamenti è stato rivisto e approvato dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Università delle Hawaii.

Media

Gli ovociti e le uova fecondate sono stati coltivati in un mezzo CZB tamponato con bicarbonato a 37,5°C con 5% di CO2 in aria. Tutte le manipolazioni degli ovociti sono state effettuate in Hepes-buffered CZB (Hepes-CZB) a temperatura ambiente (23-25°C) in aria. Il pH di entrambi i media era approssimativamente 7.4.

Micromanipolazione

Le pipette per trattenere e iniettare gli ovociti sono state preparate secondo Hogan et al. tranne che la punta della pipetta di iniezione è stata lasciata a filo dopo la rottura. Il diametro interno di questa pipetta alla sua punta era di circa 10 μm per l’enucleazione dell’ovocita ed era 7-8 μm per l’aspirazione e l’iniezione del primo corpo polare. La pipetta di iniezione è stato collegato ad un piezo elettrico pipetta-driving unità (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Giappone). La perforazione della zona pellucida e l’iniezione del corpo polare (o di uno spermatozoo) negli ovociti sono stati eseguiti come descritto in precedenza.

Preparazione degli ovociti riceventi

Le femmine B6D2F1 sono state superovulate con iniezioni consecutive di eCG (5 UI) e hCG (5 UI) a 48 ore di distanza. Circa 14 ore dopo l’iniezione di hCG, i complessi ovocita-cumulo sono stati rilasciati dagli ovidotti in Hepes-CZB. Cellule cumulo sono stati dispersi da 5-min trattamento con 0,1% ialuronidasi testicolare bovina (300 USP unità / mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) in Hepes-CZB. Gli ovociti privi di cumulo sono stati tenuti in CZB a 37,5°C sotto il 5% di CO2 in aria per meno di 1 ora prima di ulteriori trattamenti.

Enucleazione degli ovociti riceventi

L’enucleazione degli ovociti maturi è stata eseguita in Hepes-CZB contenente 5 μg/ml di citochalasina B . Gli ovociti sono stati tenuti in questo mezzo per circa 10 minuti (25°C) prima dell’enucleazione. Un ovocita, tenuto da una pipetta di tenuta, è stato ruotato fino al rilevamento di una piccola macchia ooplasmatica traslucida, la posizione dei cromosomi metafase II. Dopo che la zona pellucida è stata perforata con la pipetta di enucleazione (circa 10-μm di diametro interno) mediante l’applicazione di alcuni impulsi piezoelettrici, la sua punta è stata fatta avanzare fino a raggiungere il punto traslucido nell’ooplasma. L’ooplasma traslucido (con cromosomi in metafase II) è stato risucchiato nella pipetta senza rompere la membrana plasmatica ed è stato delicatamente tirato via dall’ovocita fino a quando un ponte citoplasmatico allungato è stato pizzicato. Come valutato dal fissaggio e dalla colorazione degli ovociti o dalla colorazione Hoechst 33342, l’efficienza dell’enucleazione era del 100%.

Identificazione dei primi corpi polari “vivi” e “morti”

Gli ovociti oviducali sono stati raccolti da femmine B6D2F1, CD1 e C3H tra 13 e 27 ore dopo l’iniezione di hCG. La vitalità dei corpi polari è stata valutata utilizzando un kit di test di vitalità cellulare disponibile in commercio (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) che differenzia tra la membrana plasmatica intatta (“live”) e le cellule danneggiate (“dead”) secondo il modello di colorazione di fluorescenza al microscopio UV. I cromosomi nei corpi polari vivi con membrane plasmatiche intatte sono diventati verdi, mentre quelli nei corpi polari morti sono diventati rosso-arancio brillante. I risultati delle nostre osservazioni primarie hanno rivelato che tutti i corpi polari vivi avevano una membrana ben definita e liscia e un citoplasma chiaro (Fig. 1A). I loro cromosomi erano sparsi, allungati o aderenti tra loro. Alcuni corpi polari morti avevano una membrana plasmatica liscia, ma nella maggior parte la membrana era ruvida o mancante. La caratteristica più facilmente riconoscibile del corpo polare morto era un citoplasma molto granulato, indipendentemente dallo stato delle membrane plasmatiche e dei cromosomi (Fig. 1B).

Trasferimento di cromosomi del primo corpo polare in ovociti enucleati e successiva iniezione di sperma

La tecnica di trasferimento e iniezione era simile a quella utilizzata per l’iniezione di nuclei di spermatidi negli ovociti. Un ovocita con un primo corpo polare vivo è stato selezionato, e la sua zona pellucida è stata forata con una pipetta da iniezione azionata da un piezo. La membrana plasmatica del corpo polare è stata rotta succhiandola nella pipetta. L’intero contenuto del corpo polare rotto è stato immediatamente iniettato in un ovocita enucleato. In una serie separata di esperimenti, è stato iniettato l’intero contenuto di un corpo polare morto. Gli ovociti iniettati con il corpo polare sono stati incubati in CZB per 2 ore a 37,5°C sotto il 5% di CO2 in aria prima di una seconda iniezione di uno spermatozoo. Immediatamente prima dell’iniezione dello sperma, i singoli spermatozoi sono stati decapitati applicando alcuni impulsi piezoelettrici alla regione del collo. Una singola testa di spermatozoo è stata iniettata in ogni ovocita come descritto da Kuretake et al. tranne che l’operazione è stata eseguita a temperatura ambiente (23-25°C) piuttosto che a 17-18°C.

Esame degli ovociti e trasferimento degli embrioni

Alcuni ovociti sono stati esaminati tra 10 min e 2 h dopo l’iniezione per determinare il comportamento dei cromosomi del corpo polare all’interno del citoplasma dell’ovocita. Altri ovociti sono stati esaminati 5-6 ore dopo per l’incidenza della fecondazione normale. Quelli con un secondo corpo polare e due pronuclei sono stati considerati normalmente fecondati e sono stati coltivati in CZB durante la notte. Gli embrioni regolari allo stadio di 2 cellule sono stati poi trasferiti negli ovidotti delle femmine riceventi che erano state accoppiate con maschi vasectomizzati durante la notte precedente.

In una serie di esperimenti, i topi C3H sono stati usati come donatori di corpi polari. Tutti gli ovociti e gli spermatozoi riceventi erano di topi B6D2F1. I topi C3H sono omologhi in quattro geni del colore dei capelli, A (agouti), B (marrone), C (albino) e D (diluito), cioè A/A, B/B, C/C, D/D. I topi B6D2F1 sono a/a,B/b,C/C,D/d. Se l’enucleazione degli ovociti B6D2F1 fosse fallita e fossero stati fecondati da spermatozoi B6D2F1, i manti di tutta la prole sarebbero stati neri (a/a,B/+,C/C,D/+), marroni (a/a,b/b,C/C,D/+) e grigi (a/a,+/+,C/C, d/d), ma non agouti o di colore bianco. Se solo i cromosomi del corpo polare C3H e i cromosomi dello sperma B6D2F1 avessero partecipato allo sviluppo degli ovociti enucleati, ci si aspetterebbe che tutta la prole avesse mantello agouti (A/a,B/+,C/C,D/+).

Al 19° giorno postcoitum, le femmine riceventi senza segni apparenti di gravidanza sono state uccise e i loro uteri sono stati esaminati per la presenza di feti. Il taglio cesareo è stato necessario perché una femmina ricevente che portava ≤ 2 feti non era in grado di partorire da sola. I feti vivi, se presenti, sono stati allevati da femmine adottive CD1 (albine) in allattamento. Alle altre femmine è stato permesso di partorire e allevare la loro prole.

Risultati

La figura 2 mostra la proporzione di primi corpi polari vitali in vari momenti dopo l’iniezione di hCG. Poiché l’ovulazione nel topo avviene tra 10 e 14 ore dopo l’iniezione di hCG, la maggior parte dei primi corpi polari sembrano essere degenerati prima o subito dopo l’ovulazione. Tuttavia, il 5-15% dei corpi polari erano vitali per molte ore dopo l’ovulazione.

Quando un primo corpo polare vivo veniva iniettato in un ovulo enucleato, i cromosomi del corpo polare si aggregavano gradualmente (Fig. 3, A e B). Entro 2 ore dall’iniezione, i cromosomi erano disposti sulla piastra di metafase della seconda divisione meiotica (Fig. 3C). I cromosomi nei corpi polari morti non si sono mai trasformati nei tipici cromosomi di metafase (Fig. 3D).

Quando un totale di 171 ovociti enucleati sono stati iniettati con primi corpi polari vivi, circa la metà è sopravvissuta (Tabella 1). Dopo l’iniezione di sperma singolo (Fig. 4A), la maggior parte degli ovociti sono stati fecondati normalmente (Fig. 4B) indipendentemente dall’età postovulatoria dei corpi polari (Tabella 1). Il trasferimento di 74 embrioni a due cellule a 11 madri adottive ha portato alla nascita di 27 figli normali (Tabella 1). Di questi, 3 sono nati con taglio cesareo di due femmine. Gli altri sono stati partoriti naturalmente. Tutti i 27 figli sono stati cresciuti e l’accoppiamento tra loro è stato effettuato. Tutte le 15 femmine sono rimaste incinte e hanno avuto cucciolate di dimensioni normali (8-12).

Discussione

I presenti risultati mostrano che i cromosomi all’interno del primo corpo polare hanno lo stesso potenziale genetico e riproduttivo di quelli rimasti nell’ovocita dopo la prima divisione meiotica. I cromosomi all’interno dei corpi polari morti non si sono organizzati dopo l’iniezione negli ovociti. I cromosomi nei corpi polari vivi erano sparsi, allungati o aggregati. Non sappiamo se c’è una relazione causale tra lo stato dei cromosomi all’interno del corpo polare e il successo/fallimento dello sviluppo embrionale dopo l’iniezione.

In condizioni normali, il primo corpo polare del topo degenera piuttosto rapidamente. Secondo Evsikov e Evsikov, più della metà degenera entro poche ore dopo l’ovulazione, e la stragrande maggioranza si disintegra durante le 12 ore successive. Negli esseri umani, al contrario, molti primi corpi polari persistono per più di 20 ore dopo l’ovulazione. In generale, tuttavia, il primo corpo polare nei mammiferi euteri ha una vita più breve del secondo corpo polare. Anche se la degenerazione dei corpi polari (e anche degli ovociti non fecondati) è probabilmente un processo apoptotico, i fattori che determinano le differenze individuali e di specie nei tassi di degenerazione dei corpi polari (e degli ovociti non fecondati) non sono compresi.

Come mostrato qui, i cromosomi vivi del primo corpo polare sono in grado di subire la seconda meiosi dopo il trasferimento in ovociti maturi indipendentemente dalla loro età postovulatoria. I cromosomi del corpo polare danneggiati, come mostrato da Rodman, sono apparentemente incapaci di farlo. Quindi, i cromosomi all’interno dei corpi polari vivi che sono destinati a degenerare possono essere salvati con il trasferimento nell’ooplasma.

Il tasso di sopravvivenza degli ovociti dopo l’iniezione del corpo polare non era molto alto (vedi Tabella 1), forse a causa delle grandi dimensioni della pipetta di iniezione. Il tasso di sopravvivenza degli ovociti può probabilmente essere aumentato attraverso miglioramenti tecnici. Inoltre, l’ovocita del mouse (circa 75 micron di diametro) ha un corpo polare relativamente grande (circa 10 micron di diametro). Operazione microchirurgica come riportato qui probabilmente si rivelerà più facile quando i corpi polari sono più piccoli rispetto alle dimensioni dell’ovocita, come negli animali (ad esempio, il bestiame) e negli esseri umani.

Anche se tecnicamente più difficile di analisi cromosomiche blastomere a causa delle minori dimensioni dei corpi polari, analisi cromosomiche corpo polare sono stati ampiamente utilizzati nella diagnosi genetica preconcezionale negli esseri umani. Dal momento che i corpi polari sono facilmente disponibili, la diagnosi genetica utilizzando i corpi polari rimarrebbe prezioso se abbiamo tenuto a mente le possibili insidie. Per gli animali da esperimento, la diagnosi genetica utilizzando i corpi polari sarebbe utile nella selezione assistita da marcatori di gameti femminili e l’identificazione di ovociti transgenici, per esempio .

Poiché è ora possibile utilizzare sia il primo che il secondo corpo polare per la produzione di prole fertile, l’informazione genetica in un ovocita può essere trasmessa a quattro prole (Fig. 5). Poiché gli ovociti donatori sono enucleati prima del trasferimento dei cromosomi del corpo polare, tutta la prole non avrà alcuna influenza genetica dagli ovociti donatori se non dai mitocondri materni (ovociti). Poiché ogni ovocita riceve uno spermatozoo diverso, questo modo di riproduzione non rappresenta la clonazione. Quattro ovociti ricevono diversi geni materni e paterni. In una situazione estrema in cui rimangono solo poche femmine di una specie, l’uso di corpi polari in questo modo potrebbe aiutare ad aumentare la diversità genetica della prole, a condizione che gli ovociti di specie strettamente correlate siano facilmente disponibili.

Riconoscimenti

Un apprezzamento speciale è espresso al Dr. J. Michael Bedford per la revisione di una prima versione del manoscritto. Ringraziamo la signora Charlotte Oser per la sua assistenza nella preparazione del manoscritto.