O Primeiro Corpo Polar Pode Ser Usado para a Produção de Descendência Normal em Ratos1

Abstract

O objectivo deste estudo foi determinar se os cromossomas no primeiro corpo polar podem participar no desenvolvimento embrionário normal. No rato, a maioria dos primeiros corpos polares degenera logo após a ovulação, mas alguns permanecem viáveis por 10 h ou mais. Quando o conteúdo de um corpo polar vivo foi injetado em um oócito maduro enucleado e examinado 2 h mais tarde, os cromossomos do corpo polar foram dispostos em uma placa de metáfase como visto antes da divisão meiótica secundária. Tais oócitos foram fertilizados normalmente através da injeção de esperma. Quando os embriões de 2 células foram transferidos para fêmeas adotivas, 30-57% desenvolveram-se em descendência fértil. Este resultado suporta uma crença antiga de que cromossomos ejectados no primeiro corpo polar têm o mesmo potencial genético que os restantes no oócito após a primeira divisão meiótica. Como os cromossomos no segundo corpo polar são conhecidos por terem pleno potencial para participar no desenvolvimento embrionário normal, é teoricamente possível reproduzir quatro descendentes usando cromossomos em um oócito.

Introdução

O oócito primário mamífero emite o primeiro corpo polar antes da ovulação. O segundo corpo polar é extrudido do oócito como consequência da activação do oócito desencadeada pelo espermatozóide fertilizante. Normalmente, os cromossomos dentro do primeiro e do segundo corpo polar degeneram sem contribuir para o desenvolvimento embrionário. A especulação de que os cromossomos de corpos polares têm o mesmo potencial genético dos cromossomos irmãos que permanecem no oócito foi provada experimentalmente por Wakayama et al. e Feng e Hall , que obtiveram descendentes vivos de camundongos através da fusão dos segundos corpos polares com óvulos fertilizados dos quais os pronúcleos femininos tinham sido removidos. Relatamos aqui que cromossomos no primeiro corpo polar também são capazes de participar do desenvolvimento embrionário normal se lhes for permitido completar a segunda divisão meiótica dentro de um oócito enucleado, e então permitir a mistura com cromossomos de um espermatozóide injetado.

Materiais e Métodos

Animais

B6D2F1 ratos fêmeas (negros), 8-10 semanas de idade, foram usados como doadores de oócitos e corpos polares. As fêmeas C3H (agouti; 10 wk de idade) e CD1 (albino; 10-15 wk de idade) também foram usadas como doadoras de corpos polares. Os espermatozóides foram coletados de caudae epididymides de machos B6D2F1, com 10 semanas de idade. As mães adoptivas foram fêmeas CD1. Os animais utilizados neste estudo foram mantidos de acordo com as diretrizes do Serviço de Animais de Laboratório da Universidade do Havaí e com aqueles preparados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa do Instituto de Recursos Laboratoriais (publicação DHEW nº 80-23, revisada em 1985). O protocolo de nosso manejo e tratamento de animais foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Havaí.

Media

Oócitos e ovos fertilizados foram cultivados em um meio CZB com bicarbonato a 37,5°C abaixo de 5% de CO2 no ar. Todas as manipulações de oócitos foram realizadas em CZB Hepes-buffered (Hepes-CZB) à temperatura ambiente (23-25°C) no ar. O pH de ambos os meios foi aproximadamente 7.4.

Micromanipulação

Pipeta de retenção e injecção de oócitos foram preparadas de acordo com Hogan et al. excepto que a ponta da pipeta de injecção foi deixada nivelada após a quebra. O diâmetro interior desta pipeta na sua ponta era aproximadamente 10 μm para enucleação de oócitos e 7-8 μm para sucção e injecção do primeiro corpo polar. A pipeta de injecção foi ligada a uma unidade piezoeléctrica de condução de pipetas (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japão). A perfuração da zona pelúcida e a injecção do corpo polar (ou um espermatozóide) em oócitos foram realizadas como descrito anteriormente .

Preparação dos Oócitos Destinatários

B6D2F1 fêmeas foram superovuladas por injecções consecutivas de eCG (5 UI) e hCG (5 UI) separados 48 h. Cerca de 14 h após a injeção de hCG, complexos oócito-cúmulos foram liberados de oviductos para Hepes-CZB. As células cumulus foram dispersas por tratamento de 5 minutos com 0,1% de hialuronidase testicular bovina (300 unidades USP/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) em Hepes-CZB. Oócitos sem módulo foram mantidos em CZB a 37,5°C abaixo de 5% de CO2 no ar por menos de 1 h antes de novos tratamentos.

Enucleação dos Oócitos receptores

Enucleação dos Oócitos maduros foi realizada em Hepes-CZB contendo 5 μg/ml de citocalasina B . Os oócitos foram mantidos neste meio durante cerca de 10 min (25°C) antes da enucleação. Um oócito, segurado por uma pipeta de retenção, foi rodado até à detecção de um pequeno ponto ooplásmico translúcido – a localização dos cromossomas da metafase II. Após a zona pelúcida ser perfurada com a pipeta de enucleação (cerca de 10-μm de diâmetro interno) por aplicação de alguns pulsos piezoplásicos, sua ponta foi avançada até atingir a mancha translúcida no ooplasma. O ooplasma translúcido (com cromossomos metafase II) foi sugado para dentro da pipeta sem romper a membrana plasmática e suavemente afastado do oócito até que uma ponte citoplasmática esticada fosse beliscada. Como avaliado pela fixação e coloração dos oócitos ou Hoechst 33342, a eficiência da enucleação foi de 100%.

Identificação dos primeiros corpos polares “vivos” e “mortos”

Oviductal de oócitos foram coletados de fêmeas B6D2F1, CD1, e C3H entre 13 e 27 h após a injeção de hCG. A viabilidade dos corpos polares foi avaliada usando um kit de teste de viabilidade celular comercialmente disponível (FertiLight vivo/morto; Sondas Moleculares, Inc., Eugene, OR) que diferencia entre células com membrana plasmática (“vivas”) e células danificadas (“mortas”) de acordo com o padrão de coloração de fluorescência sob microscópio UV. Os cromossomas em corpos polares vivos com membranas de plasma intactas fluoresceram a verde enquanto que os de corpos polares mortos fluoresceram a vermelho-laranja vivo. Os resultados das nossas observações primárias revelaram que todos os corpos polares vivos tinham uma membrana lisa e nitidamente definida e citoplasma claro (Fig. 1A). Seus cromossomos estavam dispersos, esticados ou aderentes uns aos outros. Alguns corpos polares mortos tinham uma membrana plasmática lisa, mas na maioria das vezes a membrana era áspera ou ausente. A característica mais facilmente reconhecível do corpo polar morto era um citoplasma muito granulado, independentemente do estado das membranas plasmáticas e cromossomos (Fig. 1B).

Transferência dos Primeiros Cromossomas de Corpo Polar em Oócitos Enucleados e Injeção de Espermatozóides Subsequentes

A técnica de transferência e injeção foi similar à usada para injeção de núcleos de espermatide em oócitos . Um oócito com um primeiro corpo polar vivo foi selecionado, e sua zona pelúcida foi perfurada com uma pipeta de injeção piezo-driven. A membrana plasmática do corpo polar foi quebrada ao sugá-lo para dentro da pipeta. Todo o conteúdo do corpo polar partido foi imediatamente injectado num oócito enucleado. Numa série separada de experiências, todo o conteúdo de um corpo polar morto foi injectado. Os oócitos de corpo polar injectados foram incubados em CZB durante 2 h a 37,5ºC abaixo de 5% de CO2 no ar antes de uma segunda injecção de um espermatozóide. Imediatamente antes da injecção de espermatozóides, os espermatozóides individuais foram decapitados através da aplicação de alguns pulsos piezoeléctricos na região do pescoço. Uma única cabeça de esperma foi injectada em cada oócito como descrito por Kuretake et al. excepto que a operação foi realizada à temperatura ambiente (23-25°C) em vez de a 17-18°C.

Oocyte Examination and Embryo Transfer

Alguns oócitos foram examinados entre 10 min e 2 h após a injecção para determinar como os cromossomas do corpo polar se comportaram dentro do citoplasma do oócito. Outros oócitos foram examinados 5-6 h mais tarde para a incidência de fertilização normal. Aqueles com um segundo corpo polar e dois pronúcleos foram considerados normalmente fertilizados e foram cultivados em CZB durante a noite. Embriões regulares de duas células foram então transferidos para oviductos de fêmeas receptoras que haviam sido acasaladas com machos vasectomizados durante a noite anterior.

Em uma série de experimentos, ratos C3H foram usados como doadores de corpos polares. Todos os oócitos e espermatozóides receptores eram de camundongos B6D2F1. Os camundongos C3H são homólogos em quatro genes de cor de cabelo, A (agouti), B (brown), C (albino) e D (diluído), ou seja, A/A,B/B,C/C,D/D. Os ratos B6D2F1 são a/a,B/b,C/C,D/d. Se a enucleação dos oócitos B6D2F1 tivesse falhado e eles fossem fertilizados por espermatozóides B6D2F1, as camadas de todos os descendentes teriam sido pretas (a/a,B/+,C/C,D/+), castanhas (a/a,b/b,C/C,D/+) e cinzentas (a/a,+/+,C/C, d/d), mas não agouti ou de cor branca. Se apenas os cromossomas de corpo polar C3H e os cromossomas de esperma B6D2F1 tivessem participado no desenvolvimento de oócitos enucleados, seria de esperar que todos os descendentes tivessem pelagem agouti (A/a,B/+,C/C,D/+).

No 19º dia pós-coito, as fêmeas receptoras sem sinais aparentes de gravidez foram mortas e o seu útero foi examinado para a presença de fetos. A cesariana foi necessária porque uma fêmea receptora portadora de ≤ 2 fetos não conseguiu dar à luz sozinha. Os fetos vivos, se houveram, foram criados por fêmeas de acolhimento CD1 (albinas) lactantes. Outras fêmeas foram autorizadas a dar à luz e criar os seus descendentes.

Resultados

Figure 2 mostra a proporção de primeiros corpos polares viáveis em vários momentos após a injecção de hCG. Como a ovulação no rato ocorre entre 10 e 14 h após a injeção de hCG , a maioria dos primeiros corpos polares parecem ter degenerado antes ou logo após a ovulação. No entanto, 5-15% dos corpos polares foram viáveis durante muitas horas após a ovulação.

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Nota do autor