The First Polar Body Can Be Used for Production of Normal Offspring in Mice1

干渉コントラスト光学系で見た生きた極体（A）と死んだ極体（B）（矢印）。 A′、B′）上記と同じだが、位相差光学系で見たもの。

Transfer of First Polar Body Chromosomes into Enucleated Oocytes and Subsequent Sperm Injection

精子核の卵子への注入と同様の方法で注入を行った． 第一極体が生きている卵子を選び、その透明帯にピエゾ駆動の注入ピペットを用いて穴を開けた。 極体の細胞膜をピペットに吸引して破壊した。 割れた極体の中身は、すぐに核を抜いた卵子に注入した。 別の一連の実験では、死んだ極体の内容物全体が注入された。 極体を注入した卵子は、2回目の精子注入の前に、CZB中、37.5℃、大気中5% CO2下で2時間インキュベートした。 精子注入の直前に、個々の精子を首の部分に数回のピエゾパルスを印加することによって脱嚢させた。 この操作を17-18℃ではなく室温（23-25℃）で行った以外は、呉竹らの記載と同様に、各卵母細胞に1個の精子頭を注入した。

卵子の検査と胚移植

いくつかの卵子は、極体染色体が卵子の細胞質内でどう振る舞うかを調べるために注入後10分〜2時間の間に検査した。 他の卵子は5-6時間後に正常受精の発生率を調べた。 第二極体が1つ、前核が2つあるものを正常受精とし、一晩CZBで培養した。 その後、正常な2細胞期胚を、前夜に精管切除した雄と交尾したレシピエント雌の卵管に移植した。

一連の実験において、C3Hマウスを極体ドナーとして使用した。 レシピエントの卵子と精子はすべてB6D2F1マウスのものであった。 C3HマウスはA（アグーチ）、B（ブラウン）、C（アルビノ）、D（ダイリュート）の4つの毛色遺伝子において相同性があり、すなわちA/A,B/B,C/C,D/Dとなる。 B6D2F1マウスは、a/a,B/b,C/C,D/d。 B6D2F1卵子の核出しに失敗し、B6D2F1精子と受精した場合、すべての子孫の被毛は、黒（a/a,B/+,C/D/+）、茶（a/a,B/b,C/D/+）、灰（a/a,+/+,C/C, d/d）色で、無口または白にはならなかったと思われる。 もしC3H極体染色体とB6D2F1精子染色体のみが有核卵子の発生に関与していたならば、すべての子孫がアグーチの被毛（A／a，B／+，C／C，D／+）を持つことが予想される。

生後19日目に妊娠の兆候が見られない受胎雌を殺し、胎児の存在を調べるために子宮の調査を行った。 2個以下の胎児を抱えたレシピエント雌が自力で出産できなかったため、帝王切開が必要であった。 生きた胎児がいれば、CD1（アルビノ）里親の雌が泌乳して育てた。 9853＞＜3843＞結果＜9406＞＜4860＞図2は、hCG注射後の各時刻における生存可能な第一極体の割合を示したものである。 マウスの排卵はhCG注射後10〜14時間の間に起こるので、ほとんどの第一極体は排卵前または排卵後すぐに退化したようである。 図2

マウス雑種（B6D2F1）、外来種（CD-1）および近交系（C3H）の排卵後の各時間における生きた極体の割合

生きた第一極体を核形成卵子に注入すると、極体の染色体は徐々に凝集した（図3のAおよびB）。 2時間後には第二減数分裂のメタフェース板上に染色体が整列した（図3C）。 図3

核形成卵子における極体1番染色体の第二分裂中期染色体への変化。 A）卵母細胞に注入して間もなく、染色体は散在している。 B、C)注入後2時間までに染色体は徐々に凝集し、メタフェース板上に整列。 D)

合計171個の有核卵子に生きた第一極体を注入したところ、約半数が生存した（表1）。 単精子注入後（図4A）、極体の排卵後年齢に関係なく、大部分の卵子が正常に受精した（図4B）（表1）。 74個の2細胞胚を11人の里親に移植した結果、27人の正常児が誕生した（表1）。 このうち、3人は2人の雌の帝王切開で生まれた。 その他は自然分娩であった。 27個すべてを育て、交配を行った。 表1

討論

今回の結果は、第一極体内の染色体が、第一減数分裂後の卵子に残された染色体と同じ遺伝的・生殖的可能性を秘めていることを示していた。 死んだ極体内の染色体は卵母細胞に注入しても組織化されなかった。 生きている極体内の染色体は、散在、伸展、凝集していた。 極体内の染色体の状態と注入後の胚発生の成否との間に因果関係があるかどうかはわからない。

通常の条件下では、マウスの第一極体はかなり早く退化する。 EvsikovとEvsikovによれば、排卵後数時間で半分以上が退化し、その後12時間以内に大部分が崩壊する。一方、ヒトでは、多くの第一極体が排卵後20時間以上にわたって残存する。 しかし、一般に真獣類の第一極体の寿命は第二極体よりも短い。 極体（および未受精卵）の変性はアポトーシス過程と考えられるが、極体（および未受精卵）の変性速度の個体差・種差を決定する要因は不明である。

今回示したように、生きた第1極体の染色体は排卵後の年齢にかかわらず成熟卵子への移植後に第2減数分裂を受けることが可能である。 ロッドマンが示したように、損傷した極体染色体では、明らかにそれが不可能である。

極体注入後の卵子生存率は、注入ピペットが大きいためか、あまり高くなかった（表1参照）。 卵子生存率は、おそらく技術的な改良によって向上させることができる。 また、マウスの卵子（直径約75μm）は、比較的大きな極体（直径約10μm）を持っている。

極体のサイズが小さいため、技術的には胚盤胞染色体分析よりも困難ですが、極体染色体分析は、ヒトの妊娠前遺伝子診断に広く用いられています。 極体の入手が容易であることから、極体を用いた遺伝学的診断の有用性が期待される。 実験動物の場合、極体を用いた遺伝子診断は、例えばマーカーを用いた雌性配偶子の選別やトランスジェニック卵子の同定などに有用である

現在、第1極体と第2極体の両方を用いて受胎可能な子供を作ることができるため、一つの卵子の遺伝情報を4つの子供に伝えることができる（図5）。 極体染色体を移植する前にドナー卵子を核出するため、すべての子孫は母体（卵子）のミトコンドリア以外、卵子ドナーからの遺伝的影響を受けません。 各卵母細胞は異なる精子を受け取るので、この生殖様式はクローンを意味しない。 4つの卵子は異なる母性および父性遺伝子を受け取る。 9853>

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木村

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ロッドマン

エゴスキュー

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