Az első poláris test használható a normális utódok előállításához egerekben1

Abstract

A vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy az első poláris test kromoszómái részt vehetnek-e a normális embrionális fejlődésben. Egérben az első poláris testek többsége hamarosan az ovuláció után degenerálódik, de néhány marad életképes 10 órán át vagy tovább. Amikor egy élő poláris test tartalmát egy enukleált érett petesejtbe injektáltuk, és 2 óra múlva megvizsgáltuk, a poláris test kromoszómái a másodlagos meiotikus osztódás előtt látható metafázislemezen helyezkedtek el. Az ilyen oocitákat spermiuminjekcióval normálisan megtermékenyítették. Amikor a 2 sejtes embriókat nevelőnőstényekbe ültették át, 30-57%-ukból termékeny utódok fejlődtek ki. Ez az eredmény alátámasztja azt a régóta fennálló nézetet, hogy az első poláris testbe kilökődött kromoszómák ugyanolyan genetikai potenciállal rendelkeznek, mint az első meiotikus osztódás után az oocitában maradtak. Mivel a második poláris testben lévő kromoszómákról ismert, hogy teljes potenciállal rendelkeznek a normális embrionális fejlődésben való részvételre, elméletileg lehetséges négy utód reprodukálása az egy petesejtben lévő kromoszómák felhasználásával.

Bevezetés

Az emlősök elsődleges petesejtje az ovuláció előtt kibocsátja az első poláris testet. A második poláris test a megtermékenyítő spermium által kiváltott oocita-aktiváció következményeként ürül ki az oocitából. Normális esetben mind az első, mind a második poláris testben lévő kromoszómák degenerálódnak anélkül, hogy hozzájárulnának az embrionális fejlődéshez. Azt a feltételezést, hogy a poláris testek kromoszómái ugyanolyan genetikai potenciállal rendelkeznek, mint a petesejtben maradó testvérkromoszómáik, Wakayama és munkatársai, valamint Feng és Hall kísérletileg igazolták, akik élő egér utódokat kaptak úgy, hogy a második poláris testeket olyan megtermékenyített petesejtekkel fuzionálták, amelyekből a nőstény pronukleuszokat eltávolították. Mi itt arról számolunk be, hogy az első poláris testben lévő kromoszómák is képesek részt venni a normális embrionális fejlődésben, ha hagyjuk, hogy befejezzék a második meiotikus osztódást egy enukleált petesejtben, majd hagyjuk, hogy egyesüljenek egy befecskendezett spermium kromoszómáival.

Anyagok és módszerek

Állatok

B6D2F1 nőstény egereket (fekete), 8-10 wk korúakat használtunk az oociták és a poláris testek donorjaként. C3H nőstényeket (aguti; 10 wk idős) és CD1 nőstényeket (albínó; 10-15 wk idős) szintén használtunk pólusos testek donorjaként. A spermiumokat 10 wk idős B6D2F1 hímek caudae mellékhereiből gyűjtöttük. A nevelőanyák CD1 nőstények voltak. Az ebben a vizsgálatban felhasznált állatokat a Hawaii Egyetem Laboratóriumi Állatok Szolgálatának irányelvei és a Nemzeti Kutatási Tanács Laboratóriumi Erőforrások Intézetének Laboratóriumi Állatok Gondozásával és Felhasználásával Foglalkozó Bizottsága által kidolgozott irányelvek szerint tartották (DHEW 80-23. számú, 1985-ben felülvizsgált kiadvány). Az állatok kezelésének és kezelésének protokollját a Hawaii Egyetem Állatgondozási és Állatfelhasználási Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta.

Médium

Az oocitákat és a megtermékenyített petesejteket bikarbonát-pufferelt CZB táptalajon tenyésztettük 37,5°C-on, 5% CO2 levegőn. Minden oocita manipulációt Hepes-pufferelt CZB (Hepes-CZB) táptalajban végeztünk szobahőmérsékleten (23-25°C) levegőn. Mindkét közeg pH-ja megközelítőleg 7,4 volt.

Mikromanipuláció

Az oocitatartó és injektáló pipettákat a Hogan et al. szerint készítettük el, kivéve, hogy az injektáló pipetta hegyét a törés után vízszintesen hagytuk. Ennek a pipettának a belső átmérője a hegyénél körülbelül 10 μm volt az oocita enukleációhoz és 7-8 μm az első poláris test leszívásához és befecskendezéséhez. Az injekciós pipettát egy piezoelektromos pipettahajtó egységhez (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japán) csatlakoztattuk. A zona pellucida megfúrását és a poláris test (vagy egy spermium) befecskendezését az oocitákba a korábban leírtak szerint végeztük.

A recipiens oociták előkészítése

B6D2F1 nőstényeket szuperovuláltunk egymást követő eCG (5 NE) és hCG (5 NE) injekciókkal 48 óra különbséggel. Körülbelül 14 órával a hCG-injekció beadása után a petesejt-kumulusz komplexeket a petefészekből Hepes-CZB-be engedtük. A kumulusz sejteket 0,1%-os szarvasmarha herehialuronidázzal (300 USP egység/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) történő 5 perces kezeléssel diszpergáltuk Hepes-CZB-ben. A kumuluszmentes petesejteket a további kezelések előtt kevesebb mint 1 órán át tartottuk a CZB-ben 37,5°C-on, 5%-os levegőben lévő CO2 mellett.

A recipiens petesejtek magtalanítása

A érett petesejtek magtalanítását 5 μg/ml citokalazin B-t tartalmazó Hepes-CZB-ben végeztük. Az oocitákat az enukleáció előtt kb. 10 percig tartottuk ebben a közegben (25°C). Egy tartópipettával tartott oocitát addig forgattunk, amíg egy kis, áttetsző ooplazmafoltot – a metafázis II. kromoszómák helyét – nem észleltünk. Miután a zona pellucidát az enukleációs pipettával (kb. 10 μm belső átmérőjű) néhány piezoimpulzus alkalmazásával megfúrtuk, a pipetta hegyét addig vittük előre, amíg elérte az ooplazmában lévő áttetsző foltot. Az áttetsző ooplazmát (metafázis II. kromoszómákkal) a plazmamembrán megbontása nélkül beszívtuk a pipettába, és óvatosan elhúztuk az oocitától, amíg egy megnyúlt citoplazmahidat le nem csíptünk. Az oociták rögzítésével és festésével vagy Hoechst 33342 festéssel értékelve az enukleáció hatékonysága 100% volt.

“Élő” és “halott” első poláris testek azonosítása

A B6D2F1, CD1 és C3H nőstényekből 13 és 27 órával a hCG injekció beadása után gyűjtöttünk petesejteket. A pólustestek életképességét egy kereskedelmi forgalomban kapható sejtéletképességi tesztkészlettel (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) vizsgáltuk, amely megkülönbözteti a plazmamembránnal érintetlen (“élő”) és a sérült (“halott”) sejteket a fluoreszcens festési mintázat alapján UV-mikroszkóp alatt. Az ép plazmamembránnal rendelkező élő poláris testekben lévő kromoszómák zöld színnel fluoreszkáltak, míg az elhalt poláris testekben lévő kromoszómák élénk narancsvörös színnel fluoreszkáltak. Elsődleges megfigyeléseink eredményei azt mutatták, hogy minden élő pólustest élesen körülhatárolt, sima membránnal és tiszta citoplazmával rendelkezett (1A. ábra). Kromoszómáik szétszórtak, megnyúltak vagy egymáshoz tapadtak. Néhány elhalt poláris testnek sima plazmamembránja volt, de a legtöbbnél a membrán érdes volt vagy hiányzott. Az elhalt poláris testek legkönnyebben felismerhető jellemzője az erősen granulált citoplazma volt, függetlenül a plazmamembrán és a kromoszómák állapotától (1B. ábra).

Az első pólustest kromoszómáinak átvitele enukleált petesejtekbe és az azt követő spermainjekció

A transzfer és az injekció technikája hasonló volt, mint amit a spermatidamagok petesejtekbe történő injektálásánál használtunk . Kiválasztottunk egy élő első poláris testtel rendelkező oocitát, és a zona pellucidáját piezo meghajtású injekciós pipettával kifúrtuk. A pólusos test plazmamembránját a pipettába való beszívással törtük meg. A feltört poláris test teljes tartalmát azonnal befecskendeztük egy enukleált petesejtbe. Egy külön kísérletsorozatban egy elhalt poláris test teljes tartalmát injektáltuk. A befecskendezett pólustesteket CZB-ben inkubáltuk 2 órán keresztül 37,5°C-on, 5% CO2 -os levegőn, mielőtt egy spermium második befecskendezését végeztük volna. Közvetlenül a spermainjekció előtt az egyes spermiumokat lefejeztük néhány piezoimpulzusnak a nyaki régióra történő alkalmazásával. Minden egyes petesejtbe egyetlen spermiumfejet injektáltunk a Kuretake et al. által leírt módon, azzal a különbséggel, hogy a műveletet 17-18°C helyett szobahőmérsékleten (23-25°C) végeztük.

Oociták vizsgálata és embrióátültetés

Egyes petesejteket 10 perc és 2 óra között az injektálás után megvizsgáltunk, hogy meghatározzuk, hogyan viselkednek a poláris testkromoszómák az oocita citoplazmájában. Más oocitákat 5-6 órával később vizsgáltunk a normális megtermékenyülés előfordulása szempontjából. Azokat, amelyekben egy második poláris test és két pronukleusz volt, normálisan megtermékenyítettnek tekintettük, és egy éjszakán át CZB-ben tenyésztettük. A szabályos, 2 sejtes stádiumú embriókat ezután olyan recipiens nőstények petevezetékébe ültették át, amelyeket az előző éjszaka folyamán vazektomizált hímekkel párosítottak.

Egy kísérletsorozatban C3H egereket használtak poláris test donorként. Az összes recipiens petesejt és spermium B6D2F1 egerekből származott. A C3H egerek négy szőrszíngénben homológok: A (aguti), B (barna), C (albínó) és D (híg), azaz A/A,B/B,C/C,D/D. A B6D2F1 egerek a/a,B/b,C/C,D/d. Ha a B6D2F1 petesejtek enukleációja sikertelen lett volna, és azokat B6D2F1 spermiumokkal termékenyítették volna meg, az összes utód bundája fekete (a/a,B/+,C/C,D/+), barna (a/a,b/b/b,C/C,D/+) és szürke (a/a,+/+,C/C,d/d), de nem aguti vagy fehér színű lett volna. Ha csak a C3H poláris test kromoszómái és a B6D2F1 spermium kromoszómái vettek volna részt az enukleált petesejtek fejlődésében, akkor minden utód várhatóan agouti színű (A/a,B/+,C/C,D/+) lenne.

A 19. napon a vemhesség nyilvánvaló jeleivel nem rendelkező recipiens nőstényeket megölték, és méheiket megvizsgálták a magzatok jelenléte szempontjából. Császármetszésre azért volt szükség, mert egy ≤ 2 magzatot hordozó recipiens nőstény nem tudott egyedül szülni. Az élő magzatokat, ha voltak, szoptató CD1 (albínó) nevelőnőstények nevelték fel. A többi nősténynek hagyták, hogy világra hozza és felnevelje utódait.

Eredmények

A 2. ábra az életképes első poláris testek arányát mutatja a hCG-injekciót követő különböző időpontokban. Mivel az egér ovulációja a hCG injekció beadása után 10 és 14 óra között következik be, úgy tűnik, hogy a legtöbb első pólusos test már az ovuláció előtt vagy nem sokkal utána degenerálódott. Mindazonáltal a pólustestek 5-15%-a még sok órával az ovuláció után is életképes volt.