Le premier corps polaire peut être utilisé pour la production d’une descendance normale chez la souris1

Abstract

Le but de cette étude était de déterminer si les chromosomes du premier corps polaire peuvent participer au développement embryonnaire normal. Chez la souris, la majorité des premiers corps polaires dégénèrent peu après l’ovulation, mais quelques-uns restent viables pendant 10 h ou plus. Lorsque le contenu d’un corps polaire vivant a été injecté dans un ovocyte mature énucléé et examiné 2 heures plus tard, les chromosomes du corps polaire étaient disposés sur une plaque de métaphase comme on le voit avant la division méiotique secondaire. Ces ovocytes ont été fécondés normalement par injection de sperme. Lorsque les embryons à deux cellules ont été transférés à des femelles d’accueil, 30 à 57 % se sont développés en une progéniture fertile. Ce résultat confirme une croyance de longue date selon laquelle les chromosomes éjectés dans le premier corps polaire ont le même potentiel génétique que ceux qui restent dans l’ovocyte après la première division méiotique. Comme les chromosomes du deuxième corps polaire sont connus pour avoir le plein potentiel pour participer au développement embryonnaire normal, il est théoriquement possible de reproduire quatre descendants en utilisant les chromosomes d’un seul ovocyte.

Introduction

L’ovocyte primaire de mammifère émet le premier corps polaire avant l’ovulation. Le second corps polaire est extrudé de l’ovocyte à la suite de l’activation de l’ovocyte déclenchée par le spermatozoïde fécondant. Normalement, les chromosomes du premier et du second corps polaire dégénèrent sans contribuer au développement embryonnaire. L’hypothèse selon laquelle les chromosomes des corps polaires ont le même potentiel génétique que leurs chromosomes frères restant dans l’ovocyte a été prouvée expérimentalement par Wakayama et al. et Feng et Hall , qui ont obtenu une progéniture de souris vivante en fusionnant les seconds corps polaires avec des ovules fécondés dont les pronucléus femelles avaient été retirés. Nous rapportons ici que les chromosomes du premier corps polaire sont également capables de participer au développement embryonnaire normal si on leur permet de compléter la deuxième division méiotique à l’intérieur d’un ovocyte énucléé, puis de se mêler aux chromosomes d’un spermatozoïde injecté.

Matériels et méthodes

Animaux

Les souris femelles B6D2F1 (noires), âgées de 8 à 10 semaines, ont été utilisées comme donneuses d’ovocytes et de corps polaires. Des femelles C3H (agouti ; 10 semaines) et des femelles CD1 (albinos ; 10-15 semaines) ont également été utilisées comme donneurs de corps polaires. Les spermatozoïdes ont été collectés à partir d’épididymes caudaux de mâles B6D2F1, âgés de 10 semaines. Les mères nourricières étaient des femelles CD1. Les animaux utilisés dans cette étude ont été maintenus conformément aux directives du Service des animaux de laboratoire de l’Université d’Hawaï et à celles élaborées par le Comité sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Institut des ressources de laboratoire du Conseil national de la recherche (publication DHEW n° 80-23, révisée en 1985). Le protocole de nos manipulations et traitements des animaux a été revu et approuvé par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’Hawaï.

Milieu

Les ovocytes et les œufs fécondés ont été cultivés dans un milieu CZB tamponné au bicarbonate à 37,5°C sous 5% de CO2 dans l’air. Toutes les manipulations d’ovocytes ont été effectuées dans du CZB tamponné à l’Hepes (Hepes-CZB) à température ambiante (23-25°C) à l’air. Le pH des deux milieux était d’environ 7,4.

Micromanipulation

Les pipettes de maintien et d’injection des ovocytes ont été préparées selon Hogan et al. sauf que l’extrémité de la pipette d’injection a été laissée affleurante après avoir été cassée. Le diamètre intérieur de cette pipette à son extrémité était d’environ 10 μm pour l’énucléation des ovocytes et de 7-8 μm pour l’aspiration et l’injection du premier corps polaire. La pipette d’injection était fixée à une unité d’entraînement de pipette piézoélectrique (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japon). Le forage de la zone pellucide et l’injection du corps polaire (ou d’un spermatozoïde) dans les ovocytes ont été effectués comme décrit précédemment .

Préparation des ovocytes récepteurs

Les femelles B6D2F1 ont été superovulées par des injections consécutives d’eCG (5 UI) et d’hCG (5 UI) à 48 h d’intervalle. Environ 14 h après l’injection de hCG, les complexes ovocytes-cumulus ont été libérés des oviductes dans Hepes-CZB. Les cellules du cumulus ont été dispersées par un traitement de 5 minutes avec 0,1% de hyaluronidase testiculaire bovine (300 unités USP/mg ; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) dans Hepes-CZB. Les ovocytes dépourvus de cumulus ont été conservés dans le CZB à 37,5°C sous 5% de CO2 dans l’air pendant moins de 1 h avant les traitements ultérieurs.

Enucléation des ovocytes receveurs

L’énucléation des ovocytes matures a été réalisée dans Hepes-CZB contenant 5 μg/ml de cytochalasine B . Les ovocytes ont été maintenus dans ce milieu pendant environ 10 min (25°C) avant énucléation. Un ovocyte, maintenu par une pipette de maintien, a été tourné jusqu’à la détection d’une petite tache ooplasmique translucide, emplacement des chromosomes en métaphase II. Après avoir percé la zone pellucide avec la pipette d’énucléation (environ 10-μm de diamètre interne) par l’application de quelques impulsions piézoélectriques , son extrémité a été avancée jusqu’à ce qu’elle atteigne la tache translucide dans l’ooplasme. L’ooplasme translucide (avec des chromosomes en métaphase II) a été aspiré dans la pipette sans rompre la membrane plasmique et a été doucement éloigné de l’ovocyte jusqu’à ce qu’un pont cytoplasmique étiré soit pincé. Comme évalué par la fixation et la coloration des ovocytes ou la coloration au Hoechst 33342, l’efficacité de l’énucléation était de 100%.

Identification des premiers corps polaires « vivants » et « morts »

Des ovocytes oviductaux ont été collectés à partir de femelles B6D2F1, CD1 et C3H entre 13 et 27 h après l’injection de hCG. La viabilité des corps polaires a été évaluée à l’aide d’un kit de test de viabilité cellulaire disponible dans le commerce (Live/dead FertiLight ; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) qui différencie les cellules intactes (« vivantes ») de la membrane plasmique des cellules endommagées (« mortes ») en fonction du schéma de coloration par fluorescence sous un microscope UV. Les chromosomes des corps polaires vivants dont la membrane plasmique est intacte ont émis une fluorescence verte, tandis que ceux des corps polaires morts ont émis une fluorescence orange-rouge vif. Les résultats de nos observations primaires ont révélé que tous les corps polaires vivants avaient une membrane lisse et bien définie et un cytoplasme clair (Fig. 1A). Leurs chromosomes étaient éparpillés, étirés ou adhérents les uns aux autres. Certains corps polaires morts avaient une membrane plasmique lisse, mais dans la plupart des cas, la membrane était rugueuse ou absente. La caractéristique la plus facilement reconnaissable du corps polaire mort était un cytoplasme très granulé, quel que soit l’état des membranes plasmiques et des chromosomes (Fig. 1B).

Transfert des premiers chromosomes des corps polaires dans des ovocytes énucléés et injection ultérieure de sperme

La technique de transfert et d’injection était similaire à celle utilisée pour l’injection de noyaux de spermatides dans les ovocytes . Un ovocyte avec un premier corps polaire vivant a été sélectionné, et sa zone pellucide a été percée avec une pipette d’injection à commande piézoélectrique. La membrane plasmique du corps polaire a été brisée en l’aspirant dans la pipette. Tout le contenu du corps polaire brisé a été immédiatement injecté dans un ovocyte énucléé. Dans une série d’expériences séparées, le contenu entier d’un corps polaire mort a été injecté. Les ovocytes injectés dans le corps polaire ont été incubés dans le CZB pendant 2 heures à 37,5°C sous 5% de CO2 dans l’air avant une seconde injection d’un spermatozoïde. Immédiatement avant l’injection de spermatozoïdes, les spermatozoïdes individuels ont été décapités en appliquant quelques impulsions piézoélectriques à la région du cou. Une seule tête de spermatozoïde a été injectée dans chaque ovocyte comme décrit par Kuretake et al. sauf que l’opération a été effectuée à température ambiante (23-25°C) plutôt qu’à 17-18°C.

Examen des ovocytes et transfert d’embryons

Certains ovocytes ont été examinés entre 10 min et 2 h après l’injection pour déterminer comment les chromosomes du corps polaire se comportaient dans le cytoplasme de l’ovocyte. D’autres ovocytes ont été examinés 5 à 6 h plus tard pour l’incidence d’une fécondation normale. Ceux qui présentaient un deuxième corps polaire et deux pronucléi ont été considérés comme normalement fécondés et ont été cultivés dans du CZB pendant la nuit. Des embryons réguliers au stade de 2 cellules ont ensuite été transférés dans les oviductes de femelles receveuses qui avaient été accouplées avec des mâles vasectomisés au cours de la nuit précédente.

Dans une série d’expériences, des souris C3H ont été utilisées comme donneurs de corps polaires. Tous les ovocytes et spermatozoïdes receveurs provenaient de souris B6D2F1. Les souris C3H sont homologues dans quatre gènes de couleur de poil, A (agouti), B (brun), C (albinos), et D (dilué), c’est-à-dire A/A,B/B,C/C,D/D. Les souris B6D2F1 sont a/a,B/b,C/C,D/d. Si l’énucléation des ovocytes B6D2F1 avait échoué et qu’ils avaient été fécondés par des spermatozoïdes B6D2F1, le pelage de tous les descendants aurait été noir (a/a,B/+,C/C,D/+), brun (a/a,b/b,C/C,D/+) et gris (a/a,+/+,C/C,d/d), mais pas agouti ou de couleur blanche. Si seuls les chromosomes du corps polaire C3H et les chromosomes du sperme B6D2F1 avaient participé au développement des ovocytes énucléés, on s’attendrait à ce que tous les descendants aient un pelage agouti (A/a,B/+,C/C,D/+).

Au 19ème jour postcoïtal, les femelles receveuses sans signes apparents de gestation ont été tuées et leurs utérus ont été examinés pour la présence de fœtus. Une césarienne a été nécessaire parce qu’une femelle receveuse portant ≤ 2 fœtus était incapable d’accoucher par elle-même. Les fœtus vivants, le cas échéant, ont été élevés par des femelles receveuses CD1 (albinos) en lactation. Les autres femelles ont été autorisées à accoucher et à élever leur progéniture.

Résultats

La figure 2 montre la proportion de premiers corps polaires viables à différents moments après l’injection de hCG. Comme l’ovulation chez la souris se produit entre 10 et 14 h après l’injection de hCG , la plupart des premiers corps polaires semblent avoir dégénéré avant ou peu après l’ovulation. Néanmoins, 5 à 15% des corps polaires étaient viables pendant plusieurs heures après l’ovulation.

Lorsqu’un premier corps polaire vivant a été injecté dans un ovocyte énucléé, les chromosomes du corps polaire se sont progressivement agrégés (figure 3, A et B). Deux heures après l’injection, les chromosomes étaient disposés sur la plaque métaphasique de la deuxième division méiotique (Fig. 3C). Les chromosomes des corps polaires morts ne se sont jamais transformés en chromosomes de métaphase typiques (Fig. 3D).

Lorsqu’un total de 171 ovocytes énucléés ont été injectés avec des premiers corps polaires vivants, environ la moitié a survécu (tableau 1). Après l’injection d’un seul spermatozoïde (figure 4A), la majorité des ovocytes ont été fécondés normalement (figure 4B), quel que soit l’âge postovulatoire des corps polaires (tableau 1). Le transfert de 74 embryons à deux cellules à 11 mères nourricières a donné naissance à 27 enfants normaux (Tableau 1). Parmi ceux-ci, 3 sont nés par césarienne de deux femelles. Les autres ont été mis au monde naturellement. Les 27 enfants ont été élevés et l’accouplement entre eux a été effectué. Les 15 femelles sont devenues enceintes et ont eu des portées de taille normale (8-12).

Discussion

Les présents résultats montrent que les chromosomes au sein du premier corps polaire ont les mêmes potentiels génétiques et reproductifs que ceux laissés dans l’ovocyte après la première division méiotique. Les chromosomes à l’intérieur des corps polaires morts ne se sont pas organisés après injection dans les ovocytes. Les chromosomes dans les corps polaires vivants étaient dispersés, étirés ou agrégés. Nous ne savons pas s’il existe une relation de cause à effet entre l’état des chromosomes à l’intérieur du corps polaire et le succès/échec du développement embryonnaire après injection.

Dans des conditions normales, le premier corps polaire de la souris dégénère assez rapidement. Selon Evsikov et Evsikov , plus de la moitié dégénère en quelques heures après l’ovulation, et la grande majorité se désintègre au cours des 12 h suivantes.Chez l’homme, en revanche, de nombreux premiers corps polaires persistent pendant plus de 20 h après l’ovulation . En général, cependant, le premier corps polaire des mammifères euthériens a une vie plus courte que le second corps polaire. Bien que la dégénérescence des corps polaires (et des ovocytes non fécondés également) soit probablement un processus apoptotique , les facteurs qui déterminent les différences individuelles et entre espèces dans les taux de dégénérescence des corps polaires (et des ovocytes non fécondés) ne sont pas compris.

Comme nous le montrons ici, les chromosomes vivants du premier corps polaire sont capables de subir la deuxième méiose après le transfert dans les ovocytes matures, quel que soit leur âge postovulatoire. Les chromosomes du corps polaire endommagés, comme l’a montré Rodman , sont apparemment incapables de le faire. Ainsi, les chromosomes à l’intérieur des corps polaires vivants qui sont destinés à dégénérer peuvent être sauvés en étant transférés dans l’ooplasme.

Le taux de survie des ovocytes après injection des corps polaires n’était pas très élevé (voir tableau 1), peut-être à cause de la grande taille de la pipette d’injection. Le taux de survie des ovocytes peut probablement être augmenté par des améliorations techniques. En outre, l’ovocyte de souris (environ 75 μm de diamètre) possède un corps polaire relativement grand (environ 10 μm de diamètre). L’opération microchirurgicale telle que rapportée ici s’avérera probablement plus facile lorsque les corps polaires sont plus petits par rapport à la taille de l’ovocyte, comme chez les animaux (par exemple, les bovins) et chez les humains.

Bien que techniquement plus difficile que les analyses chromosomiques des blastomères en raison de la plus petite taille des corps polaires , les analyses chromosomiques des corps polaires ont été largement utilisées dans le diagnostic génétique préconceptionnel chez les humains . Étant donné que les corps polaires sont facilement disponibles, le diagnostic génétique utilisant les corps polaires resterait valable si nous gardions à l’esprit les pièges possibles. Pour les animaux de laboratoire, le diagnostic génétique utilisant les corps polaires serait utile pour la sélection assistée par marqueur des gamètes femelles et l’identification des ovocytes transgéniques, par exemple .

Puisqu’il est maintenant possible d’utiliser à la fois le premier et le second corps polaire pour la production d’une descendance fertile, l’information génétique d’un ovocyte peut être transmise à quatre descendants (figure 5). Comme les ovocytes des donneuses sont énucléés avant le transfert des chromosomes du corps polaire, tous les descendants n’auront aucune influence génétique des donneuses d’ovocytes autre que celle des mitochondries maternelles (ovocytes). Étant donné que chaque ovocyte reçoit un spermatozoïde différent, ce mode de reproduction ne constitue pas un clonage. Quatre ovocytes reçoivent des gènes maternels et paternels différents. Dans une situation extrême où il ne reste que quelques femelles d’une espèce, l’utilisation des corps polaires de cette manière pourrait permettre d’augmenter la diversité génétique de la descendance, à condition que des ovocytes d’espèces étroitement apparentées soient facilement disponibles.

Remerciements

Nous remercions tout particulièrement le Dr J. Michael Bedford pour avoir revu une première version du manuscrit. Nous remercions Mme Charlotte Oser pour son aide dans la préparation du manuscrit.

Notes de l’auteur

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