Abstract
Tässä tutkimuksessa selvitettiin, voivatko ensimmäisen polaarisen kehon kromosomit osallistua normaaliin alkionkehitykseen. Hiirellä suurin osa ensimmäisistä polaarikappaleista rappeutuu pian ovulaation jälkeen, mutta muutama säilyy elinkelpoisena 10 tuntia tai kauemmin. Kun elävän polaarikappaleen sisältö ruiskutettiin enukleoituneeseen kypsään munasoluun ja sitä tutkittiin 2 tuntia myöhemmin, polaarikappaleen kromosomit olivat järjestäytyneet metafaasilevylle kuten ennen sekundaarista meioottista jakautumista. Tällaiset munasolut hedelmöittyivät normaalisti sperman injektiolla. Kun 2-soluiset alkiot siirrettiin kasvatusnaaraille, 30-57 prosenttia niistä kehittyi hedelmällisiksi jälkeläisiksi. Tämä tulos tukee pitkään vallinnutta käsitystä siitä, että ensimmäiseen polaarikappaleeseen ejektoituneilla kromosomeilla on sama geneettinen potentiaali kuin niillä kromosomeilla, jotka jäävät munasoluun ensimmäisen meioottisen jakautumisen jälkeen. Koska toisessa polaarikappaleessa olevilla kromosomeilla tiedetään olevan täysi potentiaali osallistua normaaliin alkionkehitykseen, on teoreettisesti mahdollista saada aikaan neljä jälkeläistä käyttämällä yhden munasolun kromosomeja.
Esittely
Nisäkkäiden primaarinen munasolu emittoi ensimmäisen polaarikappaleen ennen ovulaatiota. Toinen polaarinen runko purkautuu munasolusta hedelmöittyvän siittiöiden laukaiseman munasolun aktivoitumisen seurauksena. Normaalisti sekä ensimmäisen että toisen polaarikappaleen kromosomit degeneroituvat vaikuttamatta alkion kehitykseen. Wakayama ym. sekä Feng ja Hall osoittivat kokeellisesti, että polaarikappaleiden kromosomeilla on sama geneettinen potentiaali kuin niiden sisarkromosomeilla, jotka jäävät munasoluun, ja Feng ja Hall saivat aikaan eläviä hiiren jälkeläisiä fuusioimalla toiset polaarikappaleet hedelmöittyneisiin munasoluihin, joista naaraspuoliset kromosomit oli poistettu. Raportoimme tässä, että myös ensimmäisen polaarirungon kromosomit pystyvät osallistumaan normaaliin alkionkehitykseen, jos niiden annetaan suorittaa toinen meioottinen jakautuminen enukleoidussa munasolussa ja sen jälkeen niiden annetaan sulautua injektoidun siittiöiden kromosomeihin.
Materiaalit ja menetelmät
eläimet
Oosyyttien ja polaarielimien luovuttajina käytettiin 8-10 wk:n ikäisiä B6D2F1-naarashiiriä (musta). C3H-naaraita (agouti; 10 wk:n ikäisiä) ja CD1-naaraita (albiino; 10-15 wk:n ikäisiä) käytettiin myös napaelinten luovuttajina. Spermatozoat kerättiin 10 wk:n ikäisten B6D2F1-urosten caudae epididymideistä. Sijaisäidit olivat CD1-naaraita. Tässä tutkimuksessa käytettyjä eläimiä pidettiin Havaijin yliopiston laboratorioeläinyksikön ohjeiden ja Institute of Laboratory Resources National Research Councilin laboratorioeläinten hoitoa ja käyttöä käsittelevän komitean laatimien ohjeiden mukaisesti (DHEW-julkaisu nro 80-23, tarkistettu vuonna 1985). Havaijin yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitea on tarkastanut ja hyväksynyt eläinten käsittely- ja hoitoprotokollan.
Media
Oosyyttejä ja hedelmöittyneitä munasoluja kasvatettiin bikarbonaattipuskuroidussa CZB-mediassa 37,5 °C:n lämpötilassa 5 %:n hiilidioksidipitoisuudessa ilmassa. Kaikki munasolujen käsittelyt suoritettiin Hepes-puskuroidussa CZB-mediassa (Hepes-CZB) huoneenlämmössä (23-25 °C) ilmassa. Molempien väliaineiden pH oli noin 7,4.
Mikromanipulaatio
Oosyyttien pito- ja injektiopipetit valmistettiin Hogan et al. mukaan, paitsi että injektiopipetin kärki jätettiin murtamisen jälkeen huuhteluksi. Tämän pipetin sisähalkaisija kärjessä oli noin 10 μm munasolujen enukleaatiota varten ja 7-8 μm ensimmäisen polaarikappaleen imua ja injektiota varten. Injektiopipetti oli kiinnitetty pietsosähköiseen pipettiohjausyksikköön (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japani). Zona pellucidan poraaminen ja polaarikappaleen (tai siittiöiden) injektio munasoluihin suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.
Vastaanottavien munasolujen valmistelu
B6D2F1-naaraat superovuloitiin antamalla peräkkäin eCG- (5 IU) ja hCG-injektioita (5 IU) 48 tunnin välein. Noin 14 h hCG-injektion jälkeen munasolu-cumulus-kompleksit vapautettiin munanjohtimista Hepes-CZB:hen. Kumulussolut hajotettiin käsittelemällä ne 5 minuutin ajan 0,1-prosenttisella naudan kivesten hyaluronidaasilla (300 USP-yksikköä/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) Hepes-CZB:ssä. Cumuluksesta vapaita munasoluja pidettiin CZB:ssä 37,5 °C:ssa 5 %:n hiilidioksidipitoisuudessa ilmassa alle 1 tunnin ajan ennen jatkokäsittelyjä.
Vastaanottavien munasolujen ydintyminen
Kypsien munasolujen ydintyminen suoritettiin Hepes-CZB:ssä, joka sisälsi 5 μg/ml sytokhalasiini B:tä. Munasoluja pidettiin tässä väliaineessa noin 10 minuuttia (25 °C) ennen enukleaatiota. Pidätyspipetillä pidettyä munasolua pyöritettiin, kunnes havaittiin pieni, läpikuultava ooplasmapiste – metafaasi II:n kromosomien sijainti. Kun zona pellucidaa oli porattu enukleaatiopipetillä (sisähalkaisija noin 10 μm) muutaman pietsoimpulssin avulla, sen kärkeä vietiin eteenpäin, kunnes se saavutti läpikuultavan pisteen ooplasmassa. Läpikuultava ooplasma (jossa oli metafaasi II:n kromosomeja) imettiin pipettiin plasmakalvoa rikkomatta, ja sitä vedettiin varovasti pois munasolusta, kunnes venytetty sytoplasmasilta puristettiin pois. Kuten arvioitiin kiinnittämällä ja värjäämällä munasolut tai Hoechst 33342 -värjäyksellä, enukleaation tehokkuus oli 100 %.
”Elävien” ja ”kuolleiden” ensimmäisten polaarikappaleiden tunnistaminen
Oviduktaaliset munasolut kerättiin B6D2F1-, CD1- ja C3H-naaraspuolisilta naaraspuolisilta naaraspuolisilta naaraspuolisilta naaraspuolisilta naaraspuolisilta 13-27 tunnin kuluttua hCG-injektiosta. Polaarielinten elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa solujen elinkelpoisuustestisarjaa (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), joka erottaa plasmakalvoon jääneet (”elävät”) ja vaurioituneet (”kuolleet”) solut toisistaan fluoresenssivärjäytymiskuvion perusteella UV-mikroskoopissa. Kromosomit elävissä plasmakalvoltaan ehjissä plasmakalvoissa fluoresoivat vihreinä, kun taas kuolleissa plasmakalvoissa kromosomit fluoresoivat kirkkaan oranssinpunaisina. Ensisijaisten havaintojemme tulokset osoittivat, että kaikilla elävillä polaarielimillä oli terävästi rajattu, sileä kalvo ja kirkas sytoplasma (kuva 1A). Niiden kromosomit olivat hajallaan, venytettyjä tai kiinni toisissaan. Joillakin kuolleilla polaarielimillä oli sileä plasmakalvo, mutta useimmissa kalvo oli karkea tai puuttui. Kuolleen polaarielimen helpoimmin tunnistettava piirre oli hyvin rakeinen sytoplasma riippumatta plasmakalvojen ja kromosomien tilasta (kuva 1B) (kuva 1B).
Elävät (A) ja kuolleet (B) polaarielimet (nuolet) interferenssikontrastioptiikalla kuvattuna. A′, B′) Sama kuin edellä, mutta nähtynä vaihekontrastioptiikalla. Elävillä polaarielimillä, joiden plasmakalvot ovat ehjät, on suhteellisen kirkas sytoplasma, kun taas kuolleilla polaarielimillä, joiden plasmakalvot ovat rikkoutuneet tai puuttuvat, on rakeinen sytoplasma.
Elävät (A) ja kuolleet (B) polaarielimet (nuolet) nähtynä interferenssikontrastioptiikalla. A′, B′) Sama kuin edellä, mutta nähtynä vaihekontrastioptiikalla. Elävillä polaarielimillä, joiden plasmakalvot ovat ehjät, on suhteellisen kirkas sytoplasma, kun taas kuolleilla polaarielimillä, joiden plasmakalvot ovat rikkoutuneet tai puuttuvat, on rakeinen sytoplasma.
Ensimmäisten polaarielimien kromosomien siirto enukleoituneisiin munasoluihin ja sitä seuraava siemennesteen injektio
Tekniikka siirrossa ja injektiossa oli samankaltainen kuin siemennesteen tuman injektoinnissa siemennesteen tuman injektoinnissa munasolujen sisälle käytettiin . Valittiin munasolu, jossa oli elävä ensimmäinen polaarirunko, ja sen zona pellucida porattiin pietso-ohjatulla injektiopipetillä. Polaarirungon plasmakalvo rikottiin imemällä se pipettiin. Rikkoutuneen polaarirungon koko sisältö injektoitiin välittömästi enukleoituun munasoluun. Erillisessä koesarjassa ruiskutettiin kuolleen polaarikappaleen koko sisältö. Polaarikappaleeseen ruiskutettuja munasoluja inkuboitiin CZB:ssä 2 tuntia 37,5 °C:ssa 5 %:n hiilidioksidipitoisuudessa ilmassa ennen toisen spermatozoonin ruiskutusta. Välittömästi ennen siittiöiden injektiota yksittäiset siittiöt dekapetoitiin antamalla muutama piezopulssi kaulan alueelle. Kuhunkin munasoluun injektoitiin yksi siittiöiden pää Kuretaken ym. kuvaamalla tavalla, paitsi että toimenpide suoritettiin huoneenlämmössä (23-25 °C) eikä 17-18 °C:ssa.
Oosyyttien tutkiminen ja alkionsiirto
Joitakin munasoluja tutkittiin 10 min ja 2 h injektion jälkeen, jotta voitiin määrittää, miten polaarirungon kromosomit käyttäytyivät munasolun sytoplasmassa. Muut munasolut tutkittiin 5-6 tuntia myöhemmin normaalin hedelmöittymisen esiintymisen varalta. Ne, joissa oli yksi toinen polaarirunko ja kaksi pronukleaa, katsottiin normaalisti hedelmöittyneiksi, ja niitä viljeltiin CZB:ssä yön yli. Normaalit 2-soluisen vaiheen alkiot siirrettiin sitten sellaisten vastaanottajanaaraiden munanjohtimiin, jotka oli paritettu vasektomoitujen urosten kanssa edellisenä yönä.
Kokeiden sarjassa C3H-hiiriä käytettiin polaarielinten luovuttajina. Kaikki vastaanottajien munasolut ja siittiöt olivat peräisin B6D2F1-hiiristä. C3H-hiiret ovat homologisia neljässä karvavärigeenissä, A (agouti), B (ruskea), C (albiino) ja D (laimea), eli A/A,B/B,C/C,D/D. B6D2F1-hiiret ovat a/a,B/b,C/C,D/d. Jos B6D2F1:n munasolujen enukleaatio olisi epäonnistunut ja ne olisi hedelmöitetty B6D2F1:n siittiöillä, kaikkien jälkeläisten turkki olisi ollut musta (a/a,B/+,C/C,D/+), ruskea (a/a,b/b/b,C/C,D/+) ja harmaa (a/a,+/+,C/C,d/d), mutta ei agouti tai valkoinen. Jos vain C3H:n polaarirunkokromosomit ja B6D2F1:n siittiöiden kromosomit olisivat osallistuneet enukleoitujen munasolujen kehitykseen, kaikilla jälkeläisillä odotettaisiin olevan agouti-turkkia (A/a,B/+,C/C,D/+).
19. postcoitum-päivänä naaraat, joilla ei ollut selviä merkkejä tiineydestä, lopetettiin, ja niiden kohdunsuulla tutkittiin sikiöiden löytyminen. Keisarileikkaus oli välttämätön, koska vastaanottava naaras, jolla oli ≤ 2 sikiötä, ei pystynyt synnyttämään itse. Elävät sikiöt, jos niitä oli, kasvatettiin imettävillä CD1 (albiino) -kasvatusnaarailla. Muut naaraat saivat synnyttää ja kasvattaa jälkeläisensä.
Tulokset
Kuvassa 2 esitetään elinkelpoisten ensimmäisten polaarikappaleiden osuus eri aikoina hCG-injektion jälkeen. Koska hiiren ovulaatio tapahtuu 10-14 tunnin kuluttua hCG-injektiosta , useimmat ensimmäiset napaelimet näyttävät rappeutuneen ennen ovulaatiota tai pian sen jälkeen. Kuitenkin 5-15 % polaarielimistä oli elinkelpoisia useita tunteja ovulaation jälkeen.
Elävien polaarielimien prosenttiosuudet eri aikoina ovulaation jälkeen hiiren hybridikannassa (B6D2F1), sisäsiittoisessa kannassa (CD-1) ja sisäsiittoisessa kannassa (C3H-hiirikannassa).
Elävien polaarikappaleiden prosenttiosuudet eri ajankohtina ovulaation jälkeen hiiren hybridikannassa (B6D2F1), ulkosiitoskannassa (CD-1) ja sisäsiitoskannassa (C3H).
Kun elävä ensimmäinen polaarikappale ruiskutettiin enukleoituneeseen munasoluun, polaarikappaleen kromosomit aggregoituivat vähitellen (kuva 3, A ja B). Kahden tunnin kuluttua injektiosta kromosomit olivat järjestäytyneet toisen meioottisen jakautumisen metafaasilevylle (kuva 3C). Kuolleiden polaarirunkojen kromosomit eivät koskaan muuntuneet tyypillisiksi metafaasikromosomeiksi (kuva 3D).
Ensimmäisten polaarirunkojen kromosomien muuntuminen metafaasi II:n kromosomeiksi enukleoituneissa munasoluissa. A) Pian injektion jälkeen munasoluun; kromosomit ovat hajallaan. B, C) Kromosomit aggregoituvat vähitellen ja järjestäytyvät metafaasilevylle 2 tunnin kuluttua injektiosta. D) Kromosomit kuolleessa polaarirungossa, joka on injektoitu munasoluun, eivät voi järjestäytyä muodostamaan kromosomi-spindelikompleksia.
Ensimmäisen polaarirungon kromosomien muuntuminen metafaasi II:n kromosomeiksi enukleoituneissa munasoluissa. A) Pian injektion jälkeen munasoluun; kromosomit ovat hajallaan. B, C) Kromosomit aggregoituvat vähitellen ja järjestäytyvät metafaasilevylle 2 tunnin kuluttua injektiosta. D) Munasoluun injektoidun kuolleen polaarikappaleen kromosomit eivät voi järjestäytyä muodostamaan kromosomi-spindelikompleksia.
Kun yhteensä 171 enukleoituun munasoluun injektoitiin eläviä ensimmäisiä polaarikappaleita, noin puolet niistä jäi eloon (taulukko 1). Yksittäisen siittiöiden injektion jälkeen (kuva 4A) suurin osa munasoluista hedelmöittyi normaalisti (kuva 4B) riippumatta polaarikappaleiden postovulatorisesta iästä (taulukko 1). Kun 74 kaksisoluista alkiota siirrettiin 11 sijaisäidille, syntyi 27 normaalia jälkeläistä (taulukko 1). Näistä 3 syntyi keisarinleikkauksella kahdesta naaraasta. Muut synnytettiin luonnollisesti. Kaikki 27 jälkeläistä kasvatettiin, ja ne paritettiin keskenään. Kaikki 15 naarasta tulivat tiineiksi ja saivat normaalikokoisia pentueita (8-12).
Ensimmäisiä polaarirunkokromosomeja (Pb1c) injektoineiden hiiren enukleoitujen oosyyttien ja siittiöiden kehitys.
| Pb1c:n lähde . | Aika hCG-injektion jälkeen, kun Pb1c kerättiin . | Enukleoitujen munasolujen lukumäärä . | Siirrettyjen 2-soluisten alkioiden lukumäärä (sijaisäitien lukumäärä) . | Elävien jälkeläisten määrä (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| yhteensä . | Pb1c-injektion jälkeen elossa olevat (%) . | Normaalisti hedelmöittynyt siittiöiden injektion jälkeen . | ||||
| B6D2F1 | 15 h | 61 | 35 (57) | 30 | 28 (6) | 16 (57) |
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | 36 (3) | 18 (50) | |
| C3H | 15 h | 25 | 16 (64) | 10 | 10 (2) | 3 (30) |
| Lähde Pb1c . | Aika hCG-injektion jälkeen, kun Pb1c kerättiin . | Enukleoitujen munasolujen lukumäärä . | Siirrettyjen 2-soluisten alkioiden lukumäärä (sijaisäitien lukumäärä) . | Elävien jälkeläisten määrä (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| yhteensä . | Pb1c-injektion jälkeen elossa olevat (%) . | Normaalisti hedelmöittynyt siittiöiden injektion jälkeen . | ||||
| B6D2F1 | 15 h | 61 | 35 (57) | 30 | 28 (6) | 16 (57) |
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | 36 (3) | 18 (50) | |
| C3H | 15 h | 25 | 16 (64) | 10 | 10 (2) | 3 (30) |
Ensimmäisiä polaarirunkokromosomeja (Pb1c) ja siittiöitä injektoineiden hiiren enukleoitujen munasolujen kehitys.
| Pb1c:n lähde . | Aika hCG-injektion jälkeen, kun Pb1c kerättiin . | Enukleoitujen munasolujen lukumäärä . | Siirrettyjen 2-soluisten alkioiden lukumäärä (sijaisäitien lukumäärä) . | Elävien jälkeläisten määrä (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| yhteensä . | Pb1c-injektion jälkeen elossa olevat (%) . | Normaalisti hedelmöittynyt siittiöiden injektion jälkeen . | ||||
| B6D2F1 | 15 h | 61 | 35 (57) | 30 | 28 (6) | 16 (57) |
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | 36 (3) | 18 (50) | |
| C3H | 15 h | 25 | 16 (64) | 10 | 10 (2) | 3 (30) |
| Lähde Pb1c . | Aika hCG-injektion jälkeen, kun Pb1c kerättiin . | Enukleoitujen munasolujen lukumäärä . | Siirrettyjen 2-soluisten alkioiden lukumäärä (sijaisäitien lukumäärä) . | Elävien jälkeläisten määrä (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| yhteensä . | Pb1c-injektion jälkeen elossa olevat (%) . | Normaalisti hedelmöittynyt siittiöiden injektion jälkeen . | ||||
| B6D2F1 | 15 h | 61 | 35 (57) | 30 | 28 (6) | 16 (57) |
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | 36 (3) | 18 (50) | |
| C3H | 15 h | 25 | 16 (64) | 10 | 10 (2) | 3 (30) |
Oosyytin hedelmöittyminen ensimmäisen polaarikappaleen kromosomeilla omien kromosomiensa sijaan. A) Tämä oosyytti enukleoitiin, minkä jälkeen ensimmäiset polaarirunkokromosomit siirrettiin ja sitten injektoitiin siittiöpää. Tämä kuva otettiin noin 10 minuuttia siittiöiden injektion jälkeen; nuoli osoittaa siittiöiden päätä munasolun sisällä; c osoittaa ensimmäisen polaarirungon kromosomeja. B) Oosyytti (munasolu) 5 h sperman injektion jälkeen, jossa on kaksi pronukleaa ja yksi (toinen) polaarirunko (nuoli).
Oosyytin hedelmöittyminen ensimmäisen polaarirungon kromosomeilla omien kromosomiensa sijasta. A) Tämä oosyytti enukleoitiin, minkä jälkeen ensimmäiset polaarirunkokromosomit siirrettiin ja sitten injektoitiin siittiöpää. Tämä kuva otettiin noin 10 minuuttia siittiöiden injektion jälkeen; nuoli osoittaa siittiöiden päätä munasolun sisällä; c osoittaa ensimmäisen polaarirungon kromosomeja. B) Oosyytti (munasolu) 5 h sperman injektion jälkeen, jossa on kaksi pronukleaa ja yksi (toinen) polaarirunko (nuoli).
Keskustelu
Tämänhetkiset tulokset osoittavat, että ensimmäisen polaarirungon sisällä olevilla kromosomeilla on samat geneettiset ja lisääntymispotentiaaliset ominaisuudet kuin niillä kromosomeilla, jotka ovat jääneet ensimmäisestä meioottisesta jakaantumisesta jäljelle oosyyttiin. Kuolleiden polaarikappaleiden sisällä olevat kromosomit eivät järjestäytyneet munasoluihin pistämisen jälkeen. Elävissä polaarielimissä olevat kromosomit olivat hajallaan, venyneet tai aggregoituneet. Emme tiedä, onko polaarikappaleen sisällä olevien kromosomien tilan ja alkionkehityksen onnistumisen/epäonnistumisen välillä syy-yhteys injektion jälkeen.
Normaaleissa olosuhteissa hiiren ensimmäinen polaarikappale rappeutuu melko nopeasti. Evsikovin ja Evsikovin mukaan yli puolet degeneroituu muutamassa tunnissa ovulaation jälkeen, ja valtaosa hajoaa seuraavien 12 tunnin aikana. Ihmisillä sen sijaan monet ensimmäiset polaarikappaleet säilyvät yli 20 tuntia ovulaation jälkeen. Yleisesti ottaen nisäkkäiden ensimmäinen napaeläin elää kuitenkin lyhyemmän aikaa kuin toinen napaeläin. Vaikka polaarikappaleiden (ja myös hedelmöittymättömien munasolujen) rappeutuminen on todennäköisesti apoptoottinen prosessi , ei ymmärretä tekijöitä, jotka määräävät yksilö- ja lajierot polaarikappaleiden (ja hedelmöittymättömien munasolujen) rappeutumisnopeuksissa.
Kuten tässä osoitetaan, elävät ensimmäisen polaarikappaleen kromosomit kykenevät läpikäymään toisen meioosin sen jälkeen, kun ne on siirretty kypsien munasolujen sisään, riippumatta niiden oovulaation jälkeisestä iästä. Vaurioituneet polaarirunkokromosomit, kuten Rodman on osoittanut , eivät ilmeisesti kykene siihen. Näin ollen elävien polaarirunkojen sisällä olevat kromosomit, joiden kohtalona on degeneroitua, voidaan pelastaa siirtämällä ne ooplasmaan.
Oosyyttien eloonjäämisaste polaarirunkoinjektion jälkeen ei ollut kovin korkea (ks. taulukko 1), mikä johtui ehkä injektiopipetin suuresta koosta. Oosyyttien eloonjäämisastetta voidaan todennäköisesti lisätä teknisillä parannuksilla. Lisäksi hiiren munasolulla (halkaisija noin 75 μm) on suhteellisen suuri polaarikappale (halkaisija noin 10 μm). Tässä raportoitu mikrokirurginen operaatio osoittautuu luultavasti helpommaksi, kun polaarikappaleet ovat pienempiä suhteessa munasolun kokoon, kuten eläimillä (esim. naudoilla) ja ihmisillä.
Vaikka polaarikappaleiden pienemmän koon vuoksi polaarikappaleiden kromosomianalyysit ovatkin teknisesti vaikeampia kuin blastomeerien kromosomianalyysit , polaarikappaleiden kromosomianalyysejä on käytetty laajalti ihmisillä raskautta edeltävässä geneettisessä diagnostiikassa . Koska polaarikromosomeja on helposti saatavilla, geneettinen diagnoosi polaarikromosomeja käyttäen olisi edelleen arvokasta, jos mahdolliset sudenkuopat pidettäisiin mielessä . Koe-eläimillä geneettinen diagnoosi polaarikappaleiden avulla olisi hyödyllistä esimerkiksi naaraspuolisten sukusolujen markkeriavusteisessa valinnassa ja siirtogeenisten munasolujen tunnistamisessa .
Koska nyt on mahdollista käyttää sekä ensimmäistä että toista polaarikappaletta hedelmällisten jälkeläisten tuottamiseen, yhden munasolun geneettinen informaatio voidaan siirtää neljään jälkeläiseen (kuva 5). Koska luovuttavien munasolujen ytimet poistetaan ennen polaarirungon kromosomien siirtoa, kaikilla jälkeläisillä ei ole muuta geneettistä vaikutusta munasolujen luovuttajilta kuin äidin (munasolun) mitokondriot. Koska jokainen munasolu saa eri siittiöitä, tämä lisääntymistapa ei ole kloonausta. Neljä munasolua saa eri äidin ja isän geenit. Ääritilanteessa, jossa lajin naaraita on jäljellä vain muutama, polaarikappaleiden käyttö tällä tavoin voisi auttaa lisäämään jälkeläisten geneettistä monimuotoisuutta edellyttäen, että lähisukulaislajien munasoluja on helposti saatavilla.
Tässä kaaviossa havainnollistetaan neljän jälkeläisen tuottamista yhden munasolun kromosomeja käyttäen. Eläimestä 1 (värillinen) peräisin olevan munasolun A ensimmäinen polaarirunko siirretään eläimestä 2 (albiino) peräisin olevaan munasoluun C, joka on enukleoitu. Luku (2n, n) viittaa tässä kromosomien ploidisuuteen eikä sentromeerien lukumäärään sinänsä. Kun ensimmäiset polaarirunkokromosomit (PB I) ovat muuttuneet metafaasi II:n kromosomeiksi, pistetään yksi siittiöpää. Tämä munasolu aktivoituu, muodostaa kaksi pronuklea ja toisen polaarirungon (PB II) ja kehittyy lopulta jälkeläiseksi C. Oosyytti D on ensin enukleoitunut, minkä jälkeen siihen injektoidaan yksi siittiöpää. Kun siittiöiden pää on muuttunut pronukleukseksi aktivoituneessa munasolussa, injektoidaan munasolun C toinen polaarinen runko. Tästä munasolusta kehittyy jälkeläinen D. Jälkeläinen A kehittyy eläimen 1 munasolusta A. Jälkeläinen B syntyy siirtämällä oosyytti A:n toinen polaarinen runko oosyytti B:hen, jossa on vain siittiöiden pronukleus.
Kuvio 5
Tässä kaaviossa havainnollistetaan neljän jälkeläisen tuottamista yhden ainoan oosyyttipoikasen kromosomeja käyttäen. Eläimestä 1 (värillinen) peräisin olevan munasolun A ensimmäinen polaarirunko siirretään eläimestä 2 (albiino) peräisin olevaan munasoluun C, joka on enukleoitu. Luku (2n, n) viittaa tässä kromosomien ploidisuuteen eikä sentromeerien lukumäärään sinänsä. Kun ensimmäiset polaarirunkokromosomit (PB I) ovat muuttuneet metafaasi II:n kromosomeiksi, pistetään yksi siittiöpää. Tämä munasolu aktivoituu, muodostaa kaksi pronuklea ja toisen polaarirungon (PB II) ja kehittyy lopulta jälkeläiseksi C. Oosyytti D on ensin enukleoitunut, minkä jälkeen siihen injektoidaan yksi siittiöpää. Kun siittiöiden pää on muuttunut pronukleukseksi aktivoituneessa munasolussa, injektoidaan munasolun C toinen polaarinen runko. Tästä munasolusta kehittyy jälkeläinen D. Jälkeläinen A kehittyy eläimen 1 munasolusta A. Jälkeläinen B syntyy siirtämällä munasolun A toinen polaarinen runko munasoluun B, jossa on vain siittiöiden pronukleus.
Kiitokset
Erityistä kiitollisuutta osoitetaan tohtori J. Michael Bedfordille siitä, että hän on tarkastanut käsikirjoituksen varhaisen version. Kiitämme rouva Charlotte Oseria avusta käsikirjoituksen valmistelussa.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
.
.
; Abstract P-050.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
:
;
:
.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
.
hoidettujen aikuisten hiirten munasolujen kypsymisjakautumien, ovulaation, hedelmöittymisen ja ensimmäisen pilkkoutumisen ajoitus ja vaiheet.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
,
,
,
.
.
;
:
–
.
.
.
;
:
–
.
.
.
;
:
.
,
,
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
;
:
–
.
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
Author notes
Supported by NIH grants (HD-03402 and HD-34362). T.W. on saanut Japanin tieteen edistämisjärjestön myöntämän postdoc-apurahan.