Den första polkroppen kan användas för att producera normal avkomma hos möss1

Abstract

Syftet med den här studien var att fastställa om kromosomer i den första polkroppen kan delta i normal embryonal utveckling. Hos musen degenererar majoriteten av de första polkropparna strax efter ägglossningen, men några få förblir livskraftiga i 10 timmar eller mer. När innehållet i en levande polarkropp injicerades i en enukleerad mogen äggcell och undersöktes 2 timmar senare, var polarkroppens kromosomer arrangerade på en metafasplatta så som man ser dem före den sekundära meiotiska delningen. Sådana oocyter befruktades normalt genom injektion av spermier. När 2-cellsembryon överfördes till fosterhonor utvecklades 30-57 % till fertila avkommor. Detta resultat stöder en långvarig uppfattning att kromosomer som kastas ut i den första polkroppen har samma genetiska potential som de som finns kvar i oocyten efter den första meiotiska delningen. Eftersom kromosomerna i den andra polkroppen är kända för att ha full potential att delta i normal embryonal utveckling, är det teoretiskt möjligt att reproducera fyra avkommor genom att använda kromosomer i en oocyt.

Introduktion

Däggdjurens primära oocyt avger den första polkroppen före ägglossningen. Den andra polkroppen stöts ut från oocyten som en följd av oocytens aktivering som utlöses av den befruktade spermatozoiden. Normalt degenererar kromosomerna i både den första och den andra polkroppen utan att bidra till embryonalutvecklingen. Spekulationer om att polkropparnas kromosomer har samma genetiska potential som deras systerkromosomer som finns kvar i oocyten bevisades experimentellt av Wakayama et al. och Feng och Hall , som fick levande avkommor av mus genom att fusionera de andra polkropparna med befruktade ägg från vilka honans pronuklei hade avlägsnats. Vi rapporterar här att kromosomer i den första polkroppen också kan delta i normal embryonal utveckling om de tillåts fullfölja den andra meiotiska divisionen i en enukleerad oocyt och sedan tillåts blanda sig med kromosomer från en injicerad spermatozoid.

Material och metoder

Djur

B6D2F1-honmöss (svarta), 8-10 veckor gamla, användes som donatorer av oocyter och polarkroppar. C3H-honor (agouti, 10 veckor gamla) och CD1-honor (albino, 10-15 veckor gamla) användes också som donatorer av polkroppar. Spermatozoer samlades in från caudae epidididymider från B6D2F1-hannar, 10 veckor gamla. Fostermödrarna var CD1-honor. De djur som användes i denna undersökning hölls i enlighet med riktlinjerna från Laboratory Animal Service vid University of Hawaii och de riktlinjer som utarbetats av Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Resources National Research Council (DHEW-publikation nr 80-23, reviderad 1985). Protokollet för vår djurhantering och våra behandlingar granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of Hawaii.

Media

Oocyter och befruktade ägg odlades i ett bikarbonatbuffratbuffrat CZB-medium vid 37,5 °C under 5 % CO2 i luft. Alla oocytmanipulationer utfördes i Hepes-buffrat CZB (Hepes-CZB) vid rumstemperatur (23-25°C) i luft. pH i båda medierna var ungefär 7,4.

Mikromanipulation

Oocythållnings- och injektionspipetter preparerades enligt Hogan et al. med undantag för att spetsen på injektionspipetten lämnades slät efter att den brutits. Pipettens innerdiameter vid spetsen var cirka 10 μm för oocytens enucleation och 7-8 μm för sugning och injektion av den första polkroppen. Injektionspipetten var kopplad till en piezoelektrisk pipettdrivningsenhet (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japan). Borrning av zona pellucida och injektion av polarkropp (eller en spermatozoid) i oocyter utfördes enligt tidigare beskrivning .

Förberedelse av mottagarokyter

B6D2F1-honor superovulerades med 48 timmars mellanrum genom på varandra följande injektioner av eCG (5 IE) och hCG (5 IE). Ungefär 14 timmar efter hCG-injektionen släpptes oocyt-kumulus-komplex från ovidukterna till Hepes-CZB. Cumuluscellerna skingrades genom 5 minuters behandling med 0,1 % bovint testikelhyaluronidas (300 USP-enheter/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) i Hepes-CZB. Cumulusfria oocyter förvarades i CZB vid 37,5 °C under 5 % CO2 i luft i mindre än 1 timme före ytterligare behandlingar.

Kärnbildning av mottagande oocyter

Kärnbildning av mogna oocyter utfördes i Hepes-CZB som innehöll 5 μg/ml cytokalasin B . Oocyterna hölls i detta medium i cirka 10 minuter (25 °C) före enukleation. En oocyt, som hölls med en pipett, roterades tills en liten, genomskinlig ooplasmatisk fläck upptäcktes – platsen för kromosomerna i metafas II. Efter att zona pellucida borrats med enukleationspipetten (ca 10 μm innerdiameter) genom att applicera några piezoimpulser , fördes spetsen fram tills den nådde den genomskinliga fläcken i ooplasman. Den genomskinliga ooplasman (med kromosomer i metafas II) sögs in i pipetten utan att plasmamembranet bröts och drogs försiktigt bort från oocyten tills en utsträckt cytoplasmatisk bro klipptes bort. Enligt bedömning genom fixering och färgning av oocyterna eller färgning med Hoechst 33342 var effektiviteten av enucleation 100 %.

Identifiering av ”levande” och ”döda” första polarkroppar

Oviduktala oocyter samlades in från B6D2F1-, CD1- och C3H-honor mellan 13 och 27 h efter hCG-injektion. Polarkropparnas livskraft bedömdes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt testkit för celllivslighet (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) som skiljer mellan plasmamembranintakta (”levande”) och skadade (”döda”) celler enligt fluorescensfärgningsmönstret under ett UV-mikroskop. Kromosomerna i levande polkroppar med intakta plasmamembran fluorescerade grönt medan kromosomerna i döda polkroppar fluorescerade starkt orangerött. Resultaten av våra primära observationer visade att alla levande polkroppar hade ett skarpt definierat, slätt membran och klar cytoplasma (fig. 1A). Deras kromosomer var utspridda, utsträckta eller vidhäftande till varandra. Några döda polkroppar hade ett glatt plasmamembran, men hos de flesta var membranet grovt eller saknades. Det mest lätt igenkännliga kännetecknet på den döda polarkroppen var en mycket granulerad cytoplasma, oavsett plasmamembranens och kromosomernas tillstånd (Fig. 1B).

Diskussion

Dessa resultat visar att kromosomer inom den första polkroppen har samma genetiska och reproduktiva potential som de kromosomer som finns kvar i oocyten efter den första meiotiska delningen. Kromosomer inom döda polarkroppar organiserades inte efter injektion i oocyter. Kromosomer i levande polarkroppar var utspridda, utsträckta eller aggregerade. Vi vet inte om det finns ett orsakssamband mellan kromosomernas tillstånd inom polarkroppen och den embryonala utvecklingens framgång eller misslyckande efter injektion.

Under normala förhållanden degenererar den första polarkroppen hos musen ganska snabbt. Enligt Evsikov och Evsikov degenererar mer än hälften inom några timmar efter ägglossningen, och den stora majoriteten sönderfaller under de följande 12 timmarna. Hos människor däremot kvarstår många första polarkroppar i mer än 20 timmar efter ägglossningen . I allmänhet har dock den första polkroppen hos eutheriska däggdjur en kortare livslängd än den andra polkroppen. Även om degenerering av polkroppar (och även av obefruktade oocyter) sannolikt är en apoptotisk process , förstår man inte vilka faktorer som bestämmer de individuella och artmässiga skillnaderna i degenerationshastigheterna hos polkroppar (och obefruktade oocyter).

Som visats här kan levande kromosomer i den första polkroppen genomgå den andra meiosen efter överföring till mogna oocyter, oberoende av deras postovulatoriska ålder. Skadade polarkroppskromosomer, som visats av Rodman , kan tydligen inte göra det. Kromosomer inom levande polarkroppar som är avsedda att degenerera kan således räddas genom att överföras till ooplasma.

Oocytöverlevnaden efter injektion av polarkroppar var inte särskilt hög (se tabell 1), kanske på grund av injektionspipettens stora storlek. Överlevnaden av oocyter kan förmodligen ökas genom tekniska förbättringar. Dessutom har musens oocyt (ca 75 μm i diameter) en relativt stor polkropp (ca 10 μm i diameter). Den mikrokirurgiska operation som rapporterats här kommer förmodligen att bli lättare när polkropparna är mindre i förhållande till oocytens storlek, vilket är fallet hos djur (t.ex. nötkreatur) och människor.

Och även om det tekniskt sett är svårare att göra analyser av kromosomerna i blastomer på grund av polkropparnas mindre storlek har analyser av kromosomerna i polkropparna använts i stor utsträckning vid genetisk diagnostik av människor före graviditet och befruktning. Eftersom polkroppar är lättillgängliga skulle genetisk diagnostik med hjälp av polkroppar förbli värdefull om vi höll eventuella fallgropar i åtanke . För försöksdjur skulle genetisk diagnostik med hjälp av polkroppar vara användbar vid markörstyrt urval av honliga könsceller och identifiering av transgena oocyter, till exempel .

Då det nu är möjligt att använda både den första och den andra polkroppen för att producera fertila avkommor, kan den genetiska informationen i en oocyt överföras till fyra avkommor (fig. 5). Eftersom donatoroocyter enukleeras före överföringen av polarkroppskromosomer kommer alla avkommor inte att ha någon annan genetisk påverkan från oocytdonatorer än från moderns (oocytens) mitokondrier. Eftersom varje oocyt får en annan spermatozoid, innebär detta reproduktionssätt inte kloning. Fyra oocyter får olika moderliga och faderliga gener. I en extrem situation där endast ett fåtal honor av en art återstår kan användningen av polkroppar på detta sätt bidra till att öka den genetiska mångfalden hos avkomman, förutsatt att oocyter av närbesläktade arter är lätt tillgängliga.

Acknowledgments

Särskilt tack till Dr. J. Michael Bedford för att han granskade en tidig version av manuskriptet. Vi tackar Charlotte Oser för hennes hjälp med att förbereda manuskriptet.