První polární tělísko lze využít k produkci normálního potomstva u myší1

Abstract

Účelem této studie bylo zjistit, zda se chromozomy v prvním polárním tělísku mohou podílet na normálním embryonálním vývoji. U myší většina prvních polárních tělísek degeneruje brzy po ovulaci, ale několik z nich zůstává životaschopných po dobu 10 h nebo déle. Když byl obsah živého polárního tělíska vstříknut do enukleovaného zralého oocytu a vyšetřen o 2 h později, byly chromozomy polárního tělíska uspořádány na metafázové destičce tak, jak je vidět před sekundárním meiotickým dělením. Takové oocyty byly normálně oplodněny injekcí spermie. Při přenosu dvoubuněčných embryí náhradním samicím se 30-57 % z nich vyvinulo v plodné potomstvo. Tento výsledek podporuje dlouholetý názor, že chromozomy vyvržené do prvního polárního tělíska mají stejný genetický potenciál jako ty, které zůstaly v oocytu po prvním meiotickém dělení. Jelikož je známo, že chromozomy v druhém polárním tělísku mají plný potenciál podílet se na normálním embryonálním vývoji, je teoreticky možné reprodukovat čtyři potomky pomocí chromozomů v jednom oocytu.

Úvod

Primární oocyt savců vypouští první polární tělísko před ovulací. Druhé polární tělísko je z oocytu vytlačeno v důsledku aktivace oocytu vyvolané oplodňujícím spermatozoidem. Za normálních okolností chromozomy uvnitř prvního i druhého polárního tělíska degenerují, aniž by přispěly k embryonálnímu vývoji. Domněnku, že chromozomy polárních tělísek mají stejný genetický potenciál jako jejich sesterské chromozomy, které zůstávají v oocytu, experimentálně prokázali Wakayama et al. a Feng a Hall , kteří získali živé myší potomstvo spojením druhých polárních tělísek s oplozenými vajíčky, z nichž byla odstraněna samičí pronuklea. Zde uvádíme, že chromozomy v prvním polárním tělísku jsou rovněž schopny podílet se na normálním embryonálním vývoji, pokud se jim umožní dokončit druhé meiotické dělení v enukleovaném oocytu a poté se nechají splynout s chromozomy injikované spermie.

Materiál a metody

Zvířata

Jako dárkyně oocytů a polárních tělísek byly použity myší samice (černé) B6D2F1, staré 8-10 týdnů. Jako dárkyně polárních tělísek byly rovněž použity samice C3H (aguti; stáří 10 wk) a samice CD1 (albíni; stáří 10-15 wk). Spermie byly odebrány z kaudálních epididymidů samců B6D2F1 starých 10 týdnů. Náhradními matkami byly samice CD1. Zvířata použitá v této studii byla chována v souladu s pokyny Služby pro laboratorní zvířata na Havajské univerzitě a s pokyny vypracovanými Výborem pro péči a používání laboratorních zvířat Institutu laboratorních zdrojů Národní výzkumné rady (publikace DHEW č. 80-23, revidovaná v roce 1985). Protokol našeho zacházení se zvířaty a ošetření byl přezkoumán a schválen Výborem pro péči o zvířata a jejich použití na Havajské univerzitě.

Médium

Oocyty a oplozená vajíčka byly kultivovány v hydrogenuhličitanovém médiu CZB při 37,5 °C a 5 % CO2 na vzduchu. Veškerá manipulace s oocyty byla prováděna v CZB pufrovaném Hepesem (Hepes-CZB) při pokojové teplotě (23-25 °C) na vzduchu. Hodnota pH obou médií byla přibližně 7,4.

Mikromanipulace

Pipety pro držení a vstřikování oocytů byly připraveny podle Hogana et al. s tím rozdílem, že hrot vstřikovací pipety byl po zlomení ponechán v rovině. Vnitřní průměr této pipety v její špičce byl přibližně 10 μm pro enukleaci oocytů a byl 7-8 μm pro nasátí a injekci prvního polárního tělíska. Injekční pipeta byla připojena k piezoelektrické jednotce pohonu pipety (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japonsko). Navrtání zona pellucida a vstříknutí polárního tělíska (nebo spermie) do oocytů bylo provedeno podle předchozího popisu .

Příprava recipientních oocytů

Samice B6D2F1 byly superovulovány postupnými injekcemi eCG (5 IU) a hCG (5 IU) s odstupem 48 hodin. Přibližně 14 h po injekci hCG byly komplexy oocytů a kumulů uvolněny z oviduktů do Hepes-CZB. Kumulusy byly rozptýleny 5minutovým ošetřením 0,1% bovinní testikulární hyaluronidázou (300 USP jednotek/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) v Hepes-CZB. Oocyty bez kumulu byly před dalším zpracováním uchovávány v CZB při 37,5 °C pod 5% CO2 na vzduchu po dobu kratší než 1 h.

Enucleation of Recipient Oocytes

Enucleation of Recipient Oocytes was performed in Hepes-CZB containing 5 μg/ml cytochalasin B . Před enukleací byly oocyty ponechány v tomto médiu asi 10 minut (25 °C). Oocyt držený přídržnou pipetou byl otáčen, dokud nebyla detekována malá průsvitná ooplasmatická skvrna – místo chromozomů v metafázi II. Poté, co byla zona pellucida navrtána enukleační pipetou (o vnitřním průměru asi 10 μm) pomocí několika piezoelektrických pulzů , byl její hrot posunut, dokud nedosáhl průsvitné skvrny v ooplazmě. Průsvitná ooplazma (s chromozomy v metafázi II) byla nasáta do pipety, aniž by došlo k porušení plazmatické membrány, a byla jemně odtahována od oocytu, dokud nebyl odštípnut natažený cytoplazmatický můstek. Podle hodnocení fixace a barvení oocytů nebo barvení Hoechstem 33342 byla účinnost enukleace 100 %.

Identifikace „živých“ a „mrtvých“ prvních polárních tělísek

Oviduktální oocyty byly odebrány samicím B6D2F1, CD1 a C3H mezi 13 a 27 h po injekci hCG. Životaschopnost polárních tělísek byla hodnocena pomocí komerčně dostupné soupravy pro testování životaschopnosti buněk (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), která rozlišuje buňky s neporušenou plazmatickou membránou („živé“) a poškozené („mrtvé“) podle fluorescenčního zbarvení pod UV mikroskopem. Chromozomy v živých polárních tělíscích s neporušenou plazmatickou membránou fluoreskovaly zeleně, zatímco chromozomy v mrtvých polárních tělíscích fluoreskovaly jasně oranžově červeně. Výsledky našich primárních pozorování ukázaly, že všechna živá polární tělíska měla ostře ohraničenou, hladkou membránu a jasnou cytoplazmu (obr. 1A). Jejich chromozomy byly rozptýlené, natažené nebo k sobě přilnuté. Některá mrtvá polární tělíska měla hladkou plazmatickou membránu, ale u většiny byla membrána hrubá nebo chyběla. Nejsnáze rozpoznatelným znakem mrtvého polárního tělíska byla velmi zrnitá cytoplazma, bez ohledu na stav plazmatické membrány a chromozomů (obr. 1B).

Přenos chromozomů prvních polárních tělísek do enukleovaných oocytů a následná injekce spermie

Technika přenosu a injekce byla podobná technice použité pro injekci jader spermatid do oocytů . Byl vybrán oocyt s živým prvním polárním tělískem a jeho zona pellucida byla navrtána injekční pipetou s piezoelektrickým pohonem. Plazmatická membrána polárního tělíska byla porušena nasátím do pipety. Celý obsah rozbitého polárního tělíska byl okamžitě vstříknut do enukleovaného oocytu. V samostatné sérii pokusů byl vstříknut celý obsah mrtvého polárního tělíska. Oocyty s injikovaným polárním tělískem byly inkubovány v CZB po dobu 2 h při 37,5 °C pod 5% CO2 na vzduchu před druhou injekcí spermie. Bezprostředně před injekcí spermie byly jednotlivé spermie dekapitovány aplikací několika piezoimpulzů do oblasti krčku. Do každého oocytu byla vstříknuta jedna hlavička spermie, jak popsali Kuretake et al. s tím rozdílem, že operace byla provedena při pokojové teplotě (23-25 °C), nikoliv při 17-18 °C.

Vyšetření oocytů a přenos embrya

Některé oocyty byly vyšetřeny mezi 10 min a 2 h po injekci, aby se zjistilo, jak se v cytoplazmě oocytu chovají chromozomy polárního tělíska. Ostatní oocyty byly vyšetřeny o 5-6 h později na výskyt normálního oplodnění. Ty, které měly jedno druhé polární tělísko a dvě pronuklea, byly považovány za normálně oplozené a byly kultivovány v CZB přes noc. Pravidelná embrya ve stadiu 2 buněk byla poté přenesena do vaječníků recipientních samic, které byly během předchozí noci spářeny s vasektomovanými samci.

V sérii experimentů byly jako dárci polárních tělísek použity myši C3H. Všechny recipientní oocyty a spermie pocházely z myší B6D2F1. Myši C3H jsou homologní ve čtyřech genech pro barvu srsti, A (aguti), B (hnědá), C (albinotická) a D (zředěná), tedy A/A,B/B,C/C,D/D. Myši C3H jsou homologní ve čtyřech genech pro barvu srsti. Myši B6D2F1 jsou a/a,B/b,C/C,D/d. Pokud by enukleace oocytů B6D2F1 selhala a byly by oplodněny spermiemi B6D2F1, srst všech potomků by byla černá (a/a,B/+,C/C,D/+), hnědá (a/a,b/b,C/C,D/+) a šedá (a/a,+/+,C/C, d/d), ale ne aguti nebo bílá. Pokud by se na vývoji enukleovaných oocytů podílely pouze chromozomy polárního tělíska C3H a chromozomy spermií B6D2F1, očekávalo by se, že všichni potomci budou mít srst aguti (A/a,B/+,C/C,D/+).

19. den po porodu byly usmrceny samice příjemců bez zjevných známek březosti a jejich dělohy byly vyšetřeny na přítomnost plodů. Císařský řez byl nutný, protože recipientka nesoucí ≤ 2 plody nebyla schopna sama porodit. Případné živé plody byly odchovány kojícími náhradními samicemi CD1 (albíny). Ostatním samicím bylo umožněno porodit a vychovat své potomky.

Výsledky

Obrázek 2 ukazuje podíl životaschopných prvních polárních tělísek v různých časech po injekci hCG. Jelikož k ovulaci u myší dochází mezi 10. a 14. hodinou po injekci hCG , zdá se, že většina prvních polárních tělísek degenerovala před ovulací nebo brzy po ní. Nicméně 5-15 % polárních tělísek bylo životaschopných ještě mnoho hodin po ovulaci.

Při vstříknutí živého prvního polárního tělíska do enukleovaného oocytu docházelo k postupnému shlukování chromozomů polárního tělíska (obr. 3, A a B). Do 2 h po injekci byly chromozomy uspořádány na metafázní destičce druhého meiotického dělení (obr. 3C). Chromozomy v mrtvých polárních tělískách se nikdy nepřeměnily na typické metafázní chromozomy (obr. 3D).

Když bylo celkem 171 enukleovaným oocytům vstříknuto živé první polární tělísko, přežila přibližně polovina (tabulka 1). Po injekci jedné spermie (obr. 4A) byla většina oocytů normálně oplodněna (obr. 4B) bez ohledu na postovulační stáří polárních tělísek (tab. 1). Přenos 74 dvoubuněčných embryí 11 náhradním matkám vedl k narození 27 normálních potomků (tab. 1). Z nich se 3 narodila císařským řezem dvou samic. Ostatní se narodili přirozenou cestou. Všech 27 potomků bylo odchováno a bylo mezi nimi provedeno páření. Všech 15 samic zabřezlo a mělo vrhy normální velikosti (8-12).

Diskuse

Předložené výsledky ukazují, že chromozomy uvnitř prvního polárního tělíska mají stejný genetický a reprodukční potenciál jako chromozomy, které zůstaly v oocytu po prvním meiotickém dělení. Chromozomy uvnitř mrtvých polárních tělísek se po vstříknutí do oocytů neorganizovaly. Chromozomy v živých polárních tělíscích byly rozptýlené, roztažené nebo agregované. Nevíme, zda existuje příčinná souvislost mezi stavem chromozomů uvnitř polárního tělíska a úspěchem/neúspěchem embryonálního vývoje po injekci.

Za normálních podmínek první polární tělísko myši poměrně rychle degeneruje. Podle Evsikova a Evsikova , více než polovina degeneruje během několika hodin po ovulaci a naprostá většina se rozpadne během následujících 12 h. U lidí naopak mnohá první polární tělíska přetrvávají více než 20 h po ovulaci. Obecně však platí, že první polární tělísko u eutheriánských savců má kratší životnost než druhé polární tělísko. Ačkoli degenerace polárních tělísek (a také neoplozených oocytů) je pravděpodobně apoptotický proces , faktory, které určují individuální a druhové rozdíly v rychlosti degenerace polárních tělísek (a neoplozených oocytů), nejsou známy.

Jak se zde ukazuje, živé chromozomy prvních polárních tělísek jsou schopny projít druhou meiózou po přenosu do zralých oocytů bez ohledu na jejich postovulační stáří. Poškozené chromozomy polárních tělísek, jak ukázal Rodman , toho zřejmě nejsou schopny. Chromozomy uvnitř živých polárních tělísek, které jsou určeny k degeneraci, lze tedy zachránit přenosem do ooplazmy.

Míra přežití oocytů po injekci polárních tělísek nebyla příliš vysoká (viz tabulka 1), možná kvůli velké velikosti injekční pipety. Míru přežití oocytů lze pravděpodobně zvýšit technickým zdokonalením. Myší oocyt (o průměru asi 75 μm) má navíc poměrně velké polární tělísko (o průměru asi 10 μm). Mikrochirurgická operace, jak je zde popsána, bude pravděpodobně snazší, pokud jsou polární tělíska v poměru k velikosti oocytu menší, jako je tomu u zvířat (např. u skotu) a u lidí.

Ačkoli jsou analýzy chromozomů polárních tělísek technicky obtížnější než analýzy chromozomů blastomer kvůli menší velikosti polárních tělísek , jsou analýzy chromozomů polárních tělísek hojně využívány v prekoncepční genetické diagnostice u lidí. Jelikož jsou polární tělíska snadno dostupná, genetická diagnostika pomocí polárních tělísek by zůstala cenná, pokud bychom měli na paměti možná úskalí . U pokusných zvířat by genetická diagnostika pomocí polárních tělísek byla užitečná například při markerově asistované selekci samičích gamet a identifikaci transgenních oocytů .

Protože je nyní možné použít první i druhé polární tělísko pro produkci plodných potomků, lze genetickou informaci v jednom oocytu přenést na čtyři potomky (obr. 5). Vzhledem k tomu, že dárcovské oocyty jsou enukleovány před přenosem chromozomů polárních tělísek, nebudou mít všichni potomci žádný jiný genetický vliv dárcovských oocytů než mateřské (oocytové) mitochondrie. Protože každý oocyt obdrží jinou spermii, nepředstavuje tento způsob reprodukce klonování. Čtyři oocyty obdrží různé mateřské a otcovské geny. V extrémní situaci, kdy zbývá jen několik samic určitého druhu, může použití polárních tělísek tímto způsobem pomoci zvýšit genetickou rozmanitost potomstva za předpokladu, že jsou snadno dostupné oocyty blízce příbuzných druhů.

Poděkování

Zvláštní poděkování patří Dr. J. Michaelu Bedfordovi za recenzi rané verze rukopisu. Děkujeme paní Charlotte Oser za pomoc při přípravě rukopisu.

Poznámky autora

.