The First Polar Body Can Be Used for the Production of Normal Offspring in Mice1

Abstract

Het doel van deze studie was te bepalen of chromosomen in het eerste polaire lichaam kunnen deelnemen aan de normale embryonale ontwikkeling. Bij de muis ontaardt de meerderheid van de eerste polaire lichamen spoedig na de ovulatie, maar enkele blijven levensvatbaar gedurende 10 uur of langer. Wanneer de inhoud van een levend polair lichaam in een geënucleerde rijpe oöcyt werd geïnjecteerd en 2 uur later werd onderzocht, waren de chromosomen van het polaire lichaam gerangschikt op een metafaseplaat zoals te zien is vóór de secundaire meiotische deling. Dergelijke oöcyten werden normaal bevrucht door sperma-injectie. Wanneer 2-cellige embryo’s werden overgebracht naar pleegwijfjes, ontwikkelde 30-57% zich tot vruchtbare nakomelingen. Dit resultaat ondersteunt de al lang bestaande overtuiging dat chromosomen die in het eerste polaire lichaam worden uitgeworpen hetzelfde genetische potentieel hebben als de chromosomen die in de oöcyt achterblijven na de eerste meiotische deling. Aangezien bekend is dat de chromosomen in het tweede polaire lichaam het volledige potentieel hebben om deel te nemen aan de normale embryonale ontwikkeling, is het theoretisch mogelijk om vier nakomelingen voort te brengen door chromosomen in één eicel te gebruiken.

Inleiding

De primaire oöcyt van zoogdieren stoot het eerste polaire lichaam uit vóór de ovulatie. Het tweede polaire lichaam wordt uitgestoten uit de oöcyt als gevolg van de activering van de oöcyt door de bevruchtende spermatozoïde. Normaal gesproken ontaarden de chromosomen in zowel het eerste als het tweede polaire lichaam zonder bij te dragen aan de embryonale ontwikkeling. Speculaties dat polaire lichaam chromosomen hetzelfde genetische potentieel hebben als hun zuster chromosomen die in de oöcyt blijven werd experimenteel bewezen door Wakayama et al. en Feng en Hall , die levende muizen nakomelingen verkregen door het fuseren van de tweede polaire lichamen met bevruchte eieren waaruit vrouwelijke pronuclei waren verwijderd. Wij melden hier dat chromosomen in het eerste polaire lichaam ook in staat zijn om deel te nemen aan de normale embryonale ontwikkeling als zij in staat worden gesteld om de tweede meiotische deling binnen een geënucleerde oöcyt te voltooien, en vervolgens in staat worden gesteld om zich te vermengen met chromosomen van een geïnjecteerde spermatozoïde.

Materialen en Methoden

Dieren

B6D2F1 vrouwelijke muizen (zwart), 8-10 wk oud, werden gebruikt als de donoren van oöcyten en polaire lichamen. C3H wijfjes (agouti; 10 wk oud) en CD1 wijfjes (albino; 10-15 wk oud) werden ook gebruikt als polaire lichaam donoren. Spermatozoa werden verzameld uit caudae epididymides van B6D2F1 mannetjes, 10 wk oud. De pleegmoeders waren CD1 vrouwtjes. Dieren gebruikt in deze studie werden gehandhaafd in overeenstemming met de richtlijnen van de Laboratory Animal Service aan de Universiteit van Hawaii en met die opgesteld door het Comite voor Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren van het Institute of Laboratory Resources National Research Council (DHEW publicatie nr. 80-23, herzien in 1985). Het protocol van onze behandeling van dieren en behandelingen werd beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Hawaii.

Media

Oöcyten en bevruchte eieren werden gekweekt in een bicarbonaat-gebufferd CZB medium bij 37,5 ° C onder 5% CO2 in lucht. Alle oöcyt manipulaties werden uitgevoerd in Hepes-gebufferde CZB (Hepes-CZB) bij kamertemperatuur (23-25 ° C) in de lucht. De pH van beide media was ongeveer 7,4.

Micromanipulatie

Oocyte-houden en injecteren pipetten werden bereid volgens Hogan et al. behalve dat de punt van de injectiepipet werd verlaten flush na het breken. De binnendiameter van deze pipet aan de punt was ongeveer 10 urn voor oöcyte enucleatie en was 7-8 urn voor het zuigen en injecteren van de eerste polaire lichaam. De injectiepipet was bevestigd aan een piëzo elektrische pipet-aandrijfeenheid (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japan). Boren van de zona pellucida en de injectie van polaire lichaam (of een spermatozoön) in oöcyten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven.

Voorbereiding van de ontvanger oöcyten

B6D2F1 vrouwtjes werden superovulated door opeenvolgende injecties van eCG (5 IE) en hCG (5 IE) 48 h uit elkaar. Ongeveer 14 uur na de hCG-injectie werden de oöcyt-cumuluscomplexen uit de eileiders vrijgelaten in Hepes-CZB. Cumulus cellen werden gedispergeerd door 5-min behandeling met 0,1% boviene testiculaire hyaluronidase (300 USP eenheden / mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) in Hepes-CZB. Cumulus-vrije oöcyten werden bewaard in CZB bij 37,5 ° C onder 5% CO2 in lucht gedurende minder dan 1 uur voor verdere behandelingen.

Enucleatie van recipiënt oöcyten

Enucleatie van rijpe oöcyten werd uitgevoerd in Hepes-CZB met 5 ug / ml cytochalasine B . De oöcyten werden gehouden in dit medium gedurende ongeveer 10 minuten (25 ° C) voor enucleatie. Een oöcyt, vastgehouden door een houdpipet, werd gedraaid tot detectie van een kleine, doorschijnende ooplasmatische vlek-de locatie van metafase II chromosomen. Na de zona pellucida werd geboord met de enucleatie pipet (ongeveer 10-μm binnendiameter) door toepassing van een paar piëzo pulsen , werd de tip vooruit totdat het de doorschijnende plek in het ooplasma bereikt. Het doorschijnende ooplasma (met metafase II chromosomen) werd in de pipet gezogen zonder het plasmamembraan te breken en werd voorzichtig weggetrokken van de oöcyt totdat een uitgerekte cytoplasmatische brug werd afgeknepen. Zoals beoordeeld door fixatie en kleuring van de oöcyten of Hoechst 33342 kleuring, was de efficiëntie van enucleatie 100%.

Identificatie van “Live” en “Dead” eerste polaire lichamen

Oviductale oöcyten werden verzameld van B6D2F1, CD1, en C3H vrouwtjes tussen 13 en 27 uur na hCG injectie. De levensvatbaarheid van polaire lichamen werd beoordeeld met behulp van een commercieel verkrijgbare testkit voor de levensvatbaarheid van cellen (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) die onderscheid maakt tussen plasmamembraan-intact (“levend”) en beschadigde (“dode”) cellen op basis van het fluorescentie-kleuringpatroon onder een UV-microscoop. De chromosomen in levende polaire lichamen met intacte plasmamembranen fluoresceerden groen, terwijl die in dode polaire lichamen helder oranjerood fluoresceerden. De resultaten van onze primaire waarnemingen toonden aan dat alle levende polaire lichamen een scherp afgelijnd, glad membraan en helder cytoplasma hadden (Fig. 1A). Hun chromosomen waren verspreid, uitgerekt, of aan elkaar klevend. Sommige dode polaire lichamen hadden een glad plasmamembraan, maar bij de meeste was het membraan ruw of ontbrak het. Het gemakkelijkst herkenbare kenmerk van het dode polaire lichaam was een zeer korrelig cytoplasma, ongeacht de toestand van de plasmamembranen en chromosomen (Fig. 1B).

Transfer van eerste polaire lichaam chromosomen in geënucleerde oöcyten en daaropvolgende sperma injectie

De techniek voor overdracht en injectie was vergelijkbaar met die gebruikt voor injectie van spermatide kernen in oöcyten . Een oöcyt met een levende eerste polaire lichaam werd geselecteerd, en de zona pellucida werd geboord met een piëzo-aangedreven injectiepipet. Het plasmamembraan van het polaire lichaam werd gebroken door het in de pipet te zuigen. De volledige inhoud van het gebroken polaire lichaam werd onmiddellijk geïnjecteerd in een geënucleerde oöcyt. In een aparte serie experimenten werd de volledige inhoud van een dood polar lichaam geïnjecteerd. De geïnjecteerde polaire lichaampjes werden geïncubeerd in CZB gedurende 2 uur bij 37,5°C onder 5% CO2 in lucht vóór een tweede injectie van een spermatozoön. Onmiddellijk voor de sperma-injectie, werden individuele spermatozoa onthoofd door het toepassen van een paar piëzo pulsen op de nek regio. Een enkele sperma kop werd geïnjecteerd in elke oöcyt zoals beschreven door Kuretake et al. behalve dat de operatie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur (23-25 ° C) in plaats van bij 17-18 ° C.

Oocyte Onderzoek en Embryo Transfer

Sommige oöcyten werden onderzocht tussen 10 min en 2 uur na injectie om te bepalen hoe polaire lichaam chromosomen gedroeg zich binnen cytoplasma van de oöcyt. Andere oöcyten werden 5-6 uur later onderzocht op de incidentie van normale bevruchting. Die met een tweede polair lichaam en twee pronuclei werden beschouwd als normaal bevrucht en werden ’s nachts gekweekt in CZB. Regelmatige 2-cellig stadium embryo’s werden vervolgens overgebracht naar eileiders van ontvangende vrouwtjes die waren gepaard met gesteriliseerde mannen tijdens de voorgaande nacht.

In een reeks experimenten, werden C3H muizen gebruikt als polaire lichaam donoren. Alle ontvangende oöcyten en spermatozoa waren afkomstig van B6D2F1 muizen. C3H-muizen zijn homoloog in vier haarkleurgenen, A (agouti), B (bruin), C (albino), en D (verdund), d.w.z., A/A,B/B,C/C,D/D. B6D2F1 muizen zijn a/a,B/b,C/C,D/d. Als enucleatie van B6D2F1 oöcyten was mislukt en zij werden bevrucht door B6D2F1 spermatozoa, dan zouden de vachten van alle nakomelingen zwart (a/a,B/+,C/C,D/+), bruin (a/a,b/b,C/C,D/+), en grijs (a/a,+/+,C/C,d/d) zijn geweest, maar niet agouti of wit van kleur. Als alleen C3H polaire lichaamschromosomen en B6D2F1 spermachromosomen hadden deelgenomen aan de ontwikkeling van geënucleerde oöcyten, zouden alle nakomelingen naar verwachting agouti vachten hebben (A/a,B/+,C/C,D/+).

Op de 19e dag postcoitum, werden ontvangende wijfjes zonder duidelijke tekenen van zwangerschap gedood en hun baarmoeders werden onderzocht op de aanwezigheid van foetussen. Een keizersnede was nodig omdat een vrouwtje met ≤ 2 foetussen niet in staat was zelf te bevallen. Eventuele levende foetussen werden grootgebracht door zogende CD1 (albino) pleegteven. Andere wijfjes mochten zelf bevallen en hun nakomelingen grootbrengen.

Resultaten

Figuur 2 toont de verhouding van levensvatbare eerste poollichamen op verschillende tijdstippen na de hCG-injectie. Aangezien de ovulatie bij de muis plaatsvindt tussen 10 en 14 uur na hCG-injectie, lijken de meeste eerste polaire lichamen te zijn gedegenereerd voor of kort na de ovulatie. Niettemin was 5-15% van de poollichaampjes nog vele uren na de ovulatie levensvatbaar.

Wanneer een levend eerste poollichaampje in een uitgekomen eicel werd geïnjecteerd, werden de chromosomen van het polaire lichaam geleidelijk geaggregeerd (fig. 3, A en B). Tegen 2 uur na injectie waren de chromosomen gerangschikt op de metafaseplaat van de tweede meiotische deling (Fig. 3C). Chromosomen in dode polaire lichamen transformeerden nooit in typische metafase chromosomen (Fig. 3D).

Wanneer een totaal van 171 enucleated oöcyten werden geïnjecteerd met levende eerste polaire lichamen, overleefde ongeveer de helft (Tabel 1). Na injectie met één zaadcel (Fig. 4A) werd de meerderheid van de oöcyten normaal bevrucht (Fig. 4B), ongeacht de postovulatoire leeftijd van de polaire lichaampjes (Tabel 1). Overdracht van 74 twee-cel embryo’s aan 11 pleegmoeders resulteerde in de geboorte van 27 normale nakomelingen (Tabel 1). Hiervan werden er 3 geboren door een keizersnede bij twee wijfjes. De anderen werden op natuurlijke wijze ter wereld gebracht. Alle 27 nakomelingen werden grootgebracht en onder hen werd een paring uitgevoerd. Alle 15 wijfjes werden zwanger en kregen nesten van normale grootte (8-12).

Discussie

De huidige resultaten tonen aan dat chromosomen binnen het eerste polaire lichaam dezelfde genetische en reproductieve mogelijkheden hebben als de chromosomen die in de oöcyt achterblijven na de eerste meiotische deling. Chromosomen in dode polaire lichamen werden niet georganiseerd na injectie in oöcyten. Chromosomen in levende polaire lichamen waren verspreid, uitgerekt, of geaggregeerd. We weten niet of er een oorzakelijk verband is tussen de toestand van chromosomen binnen het polaire lichaam en het succes/falen van embryonale ontwikkeling na injectie.

Onder normale omstandigheden degenereert het eerste polaire lichaam van de muis vrij snel. Volgens Evsikov en Evsikov ontaardt meer dan de helft binnen enkele uren na de ovulatie, en de grote meerderheid desintegreert gedurende de volgende 12 uur. Bij de mens daarentegen blijven veel eerste poollichaampjes meer dan 20 uur na de ovulatie bestaan. In het algemeen echter heeft het eerste poollichaam bij eutherische zoogdieren een kortere levensduur dan het tweede poollichaam. Hoewel de degeneratie van polaire lichamen (en ook van onbevruchte oöcyten) waarschijnlijk een apoptotisch proces is , worden de factoren die de individuele en soortsverschillen in de degeneratiesnelheid van polaire lichamen (en van onbevruchte oöcyten) bepalen niet begrepen.

Zoals hier getoond, zijn levende eerste polaire lichaamschromosomen in staat om de tweede meiose te ondergaan na overdracht in rijpe oöcyten, ongeacht hun postovulatoire leeftijd. Beschadigde polaire lichaamschromosomen, zoals aangetoond door Rodman , zijn blijkbaar niet in staat om dit te doen. Derhalve kunnen chromosomen in levende polaire lichamen die bestemd zijn om te degenereren worden gered door overbrenging in het ooplasma.

De overlevingskans van de oöcyten na injectie van het polaire lichaam was niet erg hoog (zie tabel 1), misschien vanwege de grote omvang van de injectiepipet. Het overlevingspercentage van de eicel kan waarschijnlijk worden verhoogd door technische verbeteringen. Bovendien, de muis eicel (ongeveer 75 urn in diameter) heeft een relatief grote polaire lichaam (ongeveer 10 urn in diameter). Microchirurgische operatie zoals hier gerapporteerd zal waarschijnlijk gemakkelijker blijken wanneer polaire lichamen zijn kleiner in verhouding tot de grootte van de eicel, zoals bij dieren (bijv. runderen) en bij de mens.

Hoewel technisch moeilijker dan blastomeer chromosomenanalyses vanwege de kleinere omvang van polaire lichamen , zijn polaire lichaam chromosomenanalyses op grote schaal gebruikt in preconceptie genetische diagnose bij de mens. Aangezien poollichaampjes gemakkelijk beschikbaar zijn, zou genetische diagnose met behulp van poollichaampjes waardevol blijven als we rekening houden met mogelijke valkuilen . Voor proefdieren zou genetische diagnose met behulp van polaire lichaampjes bijvoorbeeld nuttig zijn bij merkergestuurde selectie van vrouwelijke gameten en identificatie van transgene oöcyten.

Aangezien het nu mogelijk is om zowel het eerste als het tweede polaire lichaam te gebruiken voor de productie van vruchtbare nakomelingen, kan de genetische informatie in één eicel worden overgedragen op vier nakomelingen (fig. 5). Aangezien donor-ocytcellen worden geënucleeerd voordat de chromosomen van het polaire lichaam worden overgedragen, zullen alle nakomelingen geen andere genetische invloed van de oöcytdonoren hebben dan van de mitochondriën van de moeder (de oöcyt). Omdat elke oöcyt een andere spermatozoïde ontvangt, komt deze wijze van voortplanting niet neer op klonen. Vier oöcyten ontvangen verschillende maternale en paternale genen. In een extreme situatie waarin slechts enkele wijfjes van een soort overblijven, zou het gebruik van polaire lichamen op deze manier kunnen helpen om de genetische diversiteit van de nakomelingen te vergroten, op voorwaarde dat oöcyten van nauw verwante soorten gemakkelijk beschikbaar zijn.

Acknowledgments

Speciale waardering gaat uit naar Dr. J. Michael Bedford voor het beoordelen van een vroege versie van het manuscript. Wij danken mevrouw Charlotte Oser voor haar hulp bij de voorbereiding van het manuscript.

Author notes