El primer cuerpo polar puede utilizarse para la producción de crías normales en ratones1

Abstract

El objetivo de este estudio era determinar si los cromosomas del primer cuerpo polar pueden participar en el desarrollo embrionario normal. En el ratón la mayoría de los primeros cuerpos polares degeneran poco después de la ovulación, pero unos pocos permanecen viables durante 10 h o más. Cuando se inyectó el contenido de un cuerpo polar vivo en un ovocito maduro enucleado y se examinó 2 h más tarde, los cromosomas del cuerpo polar estaban dispuestos en una placa de metafase como se ve antes de la división meiótica secundaria. Dichos ovocitos fueron fecundados normalmente por inyección de esperma. Cuando los embriones de 2 células se transfirieron a hembras de acogida, entre el 30 y el 57% se convirtieron en crías fértiles. Este resultado apoya la antigua creencia de que los cromosomas expulsados en el primer cuerpo polar tienen el mismo potencial genético que los que permanecen en el ovocito tras la primera división meiótica. Como se sabe que los cromosomas del segundo cuerpo polar tienen todo el potencial para participar en el desarrollo embrionario normal, es teóricamente posible reproducir cuatro crías utilizando los cromosomas de un solo ovocito.

Introducción

El ovocito primario de los mamíferos emite el primer cuerpo polar antes de la ovulación. El segundo cuerpo polar es extruido del ovocito como consecuencia de la activación del ovocito desencadenada por el espermatozoide fecundante. Normalmente, los cromosomas del primer y segundo cuerpo polar degeneran sin contribuir al desarrollo embrionario. La especulación de que los cromosomas de los cuerpos polares tienen el mismo potencial genético que sus cromosomas hermanos que permanecen en el ovocito fue probada experimentalmente por Wakayama et al. y Feng y Hall , que obtuvieron crías vivas de ratón fusionando los segundos cuerpos polares con óvulos fecundados de los que se habían eliminado los pronúcleos femeninos. Aquí informamos de que los cromosomas del primer cuerpo polar también son capaces de participar en el desarrollo embrionario normal si se les permite completar la segunda división meiótica dentro de un ovocito enucleado y luego se les permite mezclarse con los cromosomas de un espermatozoide inyectado.

Materiales y métodos

Animales

Ratones hembra B6D2F1 (negros), de 8-10 semanas de edad, fueron utilizados como donantes de ovocitos y cuerpos polares. También se utilizaron como donantes de cuerpos polares hembras C3H (agouti; 10 semanas de edad) y hembras CD1 (albinas; 10-15 semanas de edad). Los espermatozoides se recogieron de epidídimos caudales de machos B6D2F1 de 10 semanas de edad. Las madres adoptivas fueron hembras CD1. Los animales utilizados en este estudio se mantuvieron de acuerdo con las directrices del Servicio de Animales de Laboratorio de la Universidad de Hawai y con las elaboradas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación (publicación DHEW nº 80-23, revisada en 1985). El protocolo de nuestra manipulación y tratamientos con animales fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Hawai.

Medios

Los ovocitos y los huevos fertilizados se cultivaron en un medio CZB tamponado con bicarbonato a 37,5°C bajo un 5% de CO2 en aire. Todas las manipulaciones de los ovocitos se llevaron a cabo en CZB tamponado con Hepes (Hepes-CZB) a temperatura ambiente (23-25°C) en el aire. El pH de ambos medios era aproximadamente de 7,4.

Micromanipulación

Las pipetas de sujeción e inyección de ovocitos se prepararon de acuerdo con Hogan et al. excepto que la punta de la pipeta de inyección se dejó al ras después de romperse. El diámetro interior de esta pipeta en su punta era de aproximadamente 10 μm para la enucleación de ovocitos y era de 7-8 μm para la succión e inyección del primer cuerpo polar. La pipeta de inyección estaba conectada a una unidad piezoeléctrica de accionamiento de pipetas (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japón). La perforación de la zona pelúcida y la inyección del cuerpo polar (o de un espermatozoide) en los ovocitos se realizaron como se ha descrito anteriormente.

Preparación de los ovocitos receptores

Las hembras B6D2F1 fueron superovuladas mediante inyecciones consecutivas de eCG (5 UI) y hCG (5 UI) con 48 h de diferencia. Aproximadamente 14 h después de la inyección de hCG, los complejos ovocito-cúmulo fueron liberados de los oviductos en Hepes-CZB. Los cúmulos se dispersaron mediante un tratamiento de 5 minutos con hialuronidasa testicular bovina al 0,1% (300 unidades USP/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) en Hepes-CZB. Los ovocitos libres de cúmulos se mantuvieron en CZB a 37,5°C bajo un 5% de CO2 en aire durante menos de 1 h antes de los tratamientos posteriores.

Enucleación de ovocitos receptores

La nucleación de ovocitos maduros se realizó en Hepes-CZB que contenía 5 μg/ml de citocalasina B . Los ovocitos se mantuvieron en este medio durante unos 10 min (25°C) antes de la enucleación. Un ovocito, sostenido por una pipeta de sujeción, fue girado hasta la detección de una pequeña mancha ooplásmica translúcida -la ubicación de los cromosomas de la metafase II-. Después de perforar la zona pelúcida con la pipeta de enucleación (de unos 10 μm de diámetro interior) mediante la aplicación de unos pocos pulsos piezoeléctricos, se hizo avanzar su punta hasta alcanzar la mancha translúcida en el ooplasma. El ooplasma translúcido (con cromosomas en metafase II) se aspiró en la pipeta sin romper la membrana plasmática y se separó suavemente del ovocito hasta que se pellizcó un puente citoplasmático estirado. Tal y como se evaluó mediante la fijación y tinción de los ovocitos o la tinción con Hoechst 33342, la eficacia de la enucleación fue del 100%.

Identificación de los primeros cuerpos polares «vivos» y «muertos»

Se recogieron ovocitos oviductales de hembras B6D2F1, CD1 y C3H entre 13 y 27 h después de la inyección de hCG. La viabilidad de los cuerpos polares se evaluó utilizando un kit de prueba de viabilidad celular disponible en el mercado (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) que distingue entre las células con membrana plasmática intacta («vivas») y las dañadas («muertas») según el patrón de tinción de fluorescencia bajo un microscopio UV. Los cromosomas de los cuerpos polares vivos con membranas plasmáticas intactas presentaban una fluorescencia verde, mientras que los de los cuerpos polares muertos presentaban una fluorescencia naranja-roja brillante. Los resultados de nuestras observaciones primarias revelaron que todos los cuerpos polares vivos tenían una membrana bien definida y lisa y un citoplasma claro (Fig. 1A). Sus cromosomas estaban dispersos, estirados o adheridos entre sí. Algunos cuerpos polares muertos tenían una membrana plasmática lisa, pero en la mayoría la membrana era rugosa o no existía. La característica más fácilmente reconocible del cuerpo polar muerto era un citoplasma muy granulado, independientemente del estado de las membranas plasmáticas y los cromosomas (Fig. 1B).

Transferencia de cromosomas del primer cuerpo polar a ovocitos enucleados y posterior inyección de esperma

La técnica de transferencia e inyección fue similar a la utilizada para la inyección de núcleos de espermatozoides en ovocitos . Se seleccionó un ovocito con un primer cuerpo polar vivo y se perforó su zona pelúcida con una pipeta de inyección piezoeléctrica. Se rompió la membrana plasmática del cuerpo polar succionándolo en la pipeta. Todo el contenido del cuerpo polar roto se inyectó inmediatamente en un ovocito enucleado. En otra serie de experimentos, se inyectó todo el contenido de un cuerpo polar muerto. Los ovocitos inyectados en el cuerpo polar se incubaron en CZB durante 2 horas a 37,5°C bajo un 5% de CO2 en aire antes de una segunda inyección de un espermatozoide. Inmediatamente antes de la inyección de espermatozoides, se decapitaron los espermatozoides individuales aplicando algunos pulsos piezoeléctricos en la región del cuello. Se inyectó una sola cabeza de espermatozoide en cada ovocito, tal como describen Kuretake et al., salvo que la operación se realizó a temperatura ambiente (23-25°C) en lugar de a 17-18°C.

Examen de ovocitos y transferencia de embriones

Algunos ovocitos se examinaron entre 10 min y 2 h después de la inyección para determinar cómo se comportaban los cromosomas del cuerpo polar dentro del citoplasma del ovocito. Otros ovocitos se examinaron entre 5 y 6 h después para determinar la incidencia de la fecundación normal. Los que tenían un segundo cuerpo polar y dos pronúcleos se consideraron normalmente fecundados y se cultivaron en CZB durante la noche. A continuación, se transfirieron embriones normales en fase de 2 células a oviductos de hembras receptoras que se habían apareado con machos vasectomizados durante la noche anterior.

En una serie de experimentos, se utilizaron ratones C3H como donantes de cuerpos polares. Todos los ovocitos y espermatozoides receptores eran de ratones B6D2F1. Los ratones C3H son homólogos en cuatro genes de color de pelo, A (agutí), B (marrón), C (albino) y D (diluido), es decir, A/A,B/B,C/C,D/D. Los ratones B6D2F1 son a/a,B/b,C/C,D/d. Si la enucleación de los ovocitos B6D2F1 hubiera fracasado y hubieran sido fecundados por espermatozoides B6D2F1, el pelaje de todas las crías habría sido negro (a/a,B/+,C/C,D/+), marrón (a/a,b/b,C/C,D/+) y gris (a/a,+/+,C/C, d/d), pero no de color agutí o blanco. Si sólo los cromosomas del cuerpo polar C3H y los cromosomas del esperma B6D2F1 hubieran participado en el desarrollo de los ovocitos enucleados, se esperaría que toda la descendencia tuviera pelaje agutí (A/a,B/+,C/C,D/+).

En el día 19 postcoitum, las hembras receptoras sin signos aparentes de embarazo fueron sacrificadas y sus úteros fueron examinados para detectar la presencia de fetos. La cesárea fue necesaria porque una hembra receptora que llevaba ≤ 2 fetos no pudo dar a luz por sí misma. Los fetos vivos, si los había, fueron criados por hembras receptoras CD1 (albinas) lactantes. A otras hembras se les permitió parir y criar a sus crías.

Resultados

La figura 2 muestra la proporción de primeros cuerpos polares viables en varios momentos después de la inyección de hCG. Como la ovulación en el ratón se produce entre 10 y 14 h después de la inyección de hCG , la mayoría de los primeros cuerpos polares parecen haber degenerado antes o poco después de la ovulación. Sin embargo, entre el 5 y el 15% de los cuerpos polares fueron viables durante muchas horas después de la ovulación.

Cuando se inyectó un primer cuerpo polar vivo en un ovocito enucleado, los cromosomas del cuerpo polar se agregaron gradualmente (Fig. 3, A y B). A las 2 h de la inyección, los cromosomas estaban dispuestos en la placa metafásica de la segunda división meiótica (Fig. 3C). Los cromosomas de los cuerpos polares muertos nunca se transformaron en cromosomas típicos de la metafase (Fig. 3D).

Cuando un total de 171 ovocitos enucleados fueron inyectados con primeros cuerpos polares vivos, aproximadamente la mitad sobrevivió (Tabla 1). Tras la inyección de un solo espermatozoide (Fig. 4A), la mayoría de los ovocitos fueron fecundados normalmente (Fig. 4B), independientemente de la edad postovulatoria de los cuerpos polares (Tabla 1). La transferencia de 74 embriones bicelulares a 11 madres adoptivas dio lugar al nacimiento de 27 crías normales (Tabla 1). De ellas, 3 nacieron por cesárea de dos hembras. Los demás nacieron de forma natural. Las 27 crías fueron criadas y se realizó el apareamiento entre ellas. Las 15 hembras quedaron preñadas y tuvieron camadas de tamaño normal (8-12).

Discusión

Los presentes resultados muestran que los cromosomas dentro del primer cuerpo polar tienen los mismos potenciales genéticos y reproductivos que los que quedan en el ovocito después de la primera división meiótica. Los cromosomas dentro de los cuerpos polares muertos no se organizaron después de la inyección en los ovocitos. Los cromosomas de los cuerpos polares vivos estaban dispersos, estirados o agregados. No sabemos si existe una relación causal entre el estado de los cromosomas dentro del cuerpo polar y el éxito/fracaso del desarrollo embrionario tras la inyección.

En condiciones normales, el primer cuerpo polar del ratón degenera con bastante rapidez. Según Evsikov y Evsikov , más de la mitad degenera a las pocas horas de la ovulación, y la gran mayoría se desintegra durante las siguientes 12 h. En los humanos, por el contrario, muchos primeros cuerpos polares persisten durante más de 20 h después de la ovulación . En general, sin embargo, el primer cuerpo polar de los mamíferos euterios tiene una vida más corta que el segundo cuerpo polar. Aunque es probable que la degeneración de los cuerpos polares (y también de los ovocitos no fecundados) sea un proceso apoptótico, no se conocen los factores que determinan las diferencias individuales y de especie en las tasas de degeneración de los cuerpos polares (y de los ovocitos no fecundados).

Como se muestra aquí, los cromosomas vivos del primer cuerpo polar son capaces de someterse a la segunda meiosis después de la transferencia a los ovocitos maduros, independientemente de su edad postovulatoria. Los cromosomas del cuerpo polar dañados, como ha demostrado Rodman , son aparentemente incapaces de hacerlo. Por lo tanto, los cromosomas dentro de los cuerpos polares vivos que están destinados a degenerar pueden ser rescatados al ser transferidos al ooplasma.

La tasa de supervivencia de los ovocitos después de la inyección de cuerpos polares no fue muy alta (ver Tabla 1), quizás debido al gran tamaño de la pipeta de inyección. La tasa de supervivencia de los ovocitos puede probablemente aumentarse mediante mejoras técnicas. Además, el ovocito de ratón (de unos 75 μm de diámetro) tiene un cuerpo polar relativamente grande (de unos 10 μm de diámetro). La operación microquirúrgica, tal y como se informa aquí, probablemente resultará más fácil cuando los cuerpos polares sean más pequeños en relación con el tamaño del ovocito, como en los animales (por ejemplo, el ganado) y en los seres humanos.

Aunque técnicamente es más difícil que los análisis cromosómicos de los blastómeros debido al menor tamaño de los cuerpos polares , los análisis cromosómicos de los cuerpos polares se han utilizado ampliamente en el diagnóstico genético previo a la concepción en los seres humanos . Dado que los cuerpos polares están fácilmente disponibles, el diagnóstico genético mediante cuerpos polares seguirá siendo valioso si tenemos en cuenta los posibles riesgos. En el caso de los animales de experimentación, el diagnóstico genético mediante cuerpos polares sería útil para la selección de gametos femeninos asistida por marcadores y la identificación de ovocitos transgénicos, por ejemplo.

Dado que ahora es posible utilizar tanto el primer como el segundo cuerpo polar para la producción de crías fértiles, la información genética de un ovocito puede transmitirse a cuatro crías (Fig. 5). Como los ovocitos donantes se enuclean antes de la transferencia de los cromosomas del cuerpo polar, toda la descendencia no tendrá ninguna influencia genética de los ovocitos donantes que no sea la de las mitocondrias maternas (del ovocito). Como cada ovocito recibe un espermatozoide diferente, este modo de reproducción no representa una clonación. Cuatro ovocitos reciben genes maternos y paternos diferentes. En una situación extrema en la que sólo queden unas pocas hembras de una especie, el uso de cuerpos polares de esta manera podría ayudar a aumentar la diversidad genética de la descendencia, siempre que se disponga de ovocitos de especies estrechamente relacionadas.

Agradecimientos

Se expresa un agradecimiento especial al Dr. J. Michael Bedford por revisar una versión temprana del manuscrito. Agradecemos a la Sra. Charlotte Oser su ayuda en la preparación del manuscrito.