Abstract
Sigtet med denne undersøgelse var at afgøre, om kromosomer i det første polarkrop kan deltage i den normale embryonale udvikling. Hos musen degenererer størstedelen af de første pollegemer kort efter ægløsning, men nogle få forbliver levedygtige i 10 timer eller mere. Da indholdet af et levende pollegeme blev injiceret i en enucleated moden oocyt og undersøgt 2 timer senere, var pollegemets kromosomer anbragt på en metafaseplade, som det ses før den sekundære meiotiske deling. Sådanne oocytter blev befrugtet normalt ved injektion af sædceller. Når 2-cellede embryoner blev overført til fosterhunner, udviklede 30-57 % sig til fertile afkom. Dette resultat understøtter en gammel opfattelse af, at kromosomer, der kastes ud i det første polære legeme, har samme genetiske potentiale som de kromosomer, der forbliver i oocytten efter den første meiotiske deling. Da kromosomerne i det andet pollegeme vides at have fuldt potentiale til at deltage i den normale embryonale udvikling, er det teoretisk muligt at reproducere fire afkom ved at bruge kromosomer i én oocyt.
Indledning
Pattedyrenes primære oocyt udsender det første pollegeme før ægløsningen. Det andet pollegeme udstødes fra oocytten som følge af oocytaktivering, der udløses af den befrugtende sædcelle. Normalt degenererer kromosomerne i både det første og det andet pollegeme uden at bidrage til den embryonale udvikling. Spekulationer om, at kromosomer fra polkroppen har samme genetiske potentiale som deres søsterkromosomer, der forbliver i oocytten, blev eksperimentelt bevist af Wakayama et al. og Feng og Hall , som opnåede levende afkom af mus ved at fusionere den anden polkroppe med befrugtede æg, hvorfra hunkromosomer var blevet fjernet. Vi rapporterer her, at kromosomer i det første pollegeme også er i stand til at deltage i den normale embryonale udvikling, hvis de får lov til at fuldføre den anden meiotiske deling i en enukleeret oocyt, hvorefter de får lov til at blande sig med kromosomer fra en injiceret spermatozoon.
Materialer og metoder
Dyr
B6D2F1 hunmus (sorte), 8-10 uger gamle, blev anvendt som donorer af oocytter og polære legemer. C3H-hunner (agouti; 10 uger gamle) og CD1-hunner (albino; 10-15 uger gamle) blev også anvendt som donorer af polære legemer. Spermatozoer blev indsamlet fra caudae epidididymider af B6D2F1-hanner, 10 uger gamle. Plejemødre var CD1-hunner. De dyr, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev holdt i overensstemmelse med retningslinjerne fra Laboratory Animal Service ved University of Hawaii og med retningslinjerne udarbejdet af Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Resources National Research Council (DHEW-publikation nr. 80-23, revideret i 1985). Protokollen for vores dyrehåndtering og behandlinger blev gennemgået og godkendt af Udvalget for Dyrepleje og -anvendelse ved University of Hawaii.
Medier
Oocytter og befrugtede æg blev dyrket i et bicarbonatbufferet CZB-medium ved 37,5 °C under 5 % CO2 i luft. Alle oocytmanipulationer blev udført i Hepes-bufferet CZB (Hepes-CZB) ved stuetemperatur (23-25°C) i luft. pH-værdien af begge medier var ca. 7,4.
Mikromanipulation
Oocyt-holding- og injektionspipetter blev fremstillet i henhold til Hogan et al. bortset fra, at spidsen af injektionspipetten blev efterladt skyllet efter brud. Pipettens indvendige diameter ved spidsen var ca. 10 μm til oocyt- enucleation og var 7-8 μm til sugning og injektion af det første polære legeme. Injektionspipetten var fastgjort til en piezoelektrisk pipettedrevsenhed (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japan). Boring af zona pellucida og injektion af pollegeme (eller en spermatozoon) i oocytter blev udført som beskrevet tidligere .
Fremstilling af modtageroocytter
B6D2F1-hunner blev superovuleret ved på hinanden følgende injektioner af eCG (5 IE) og hCG (5 IE) med 48 timers mellemrum. Ca. 14 timer efter hCG-injektion blev oocyt-kumulus-komplekser frigivet fra ovidukterne i Hepes-CZB. Cumuluscellerne blev spredt ved 5-min behandling med 0,1% bovin testikelhyaluronidase (300 USP-enheder/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) i Hepes-CZB i 5 minutter. Cumulus-frie oocytter blev opbevaret i CZB ved 37,5 °C under 5 % CO2 i luft i mindre end 1 time før yderligere behandlinger.
Kerneudskillelse af modtagende oocytter
Kerneudskillelse af modne oocytter blev udført i Hepes-CZB indeholdende 5 μg/ml cytochalasin B . Oocyterne blev opbevaret i dette medium i ca. 10 minutter (25 °C) før enukleation. En oocyt, der blev holdt med en pipette, blev roteret, indtil der blev fundet en lille, gennemsigtig ooplasmatisk plet, som er placeringen af kromosomer i metafase II. Efter at zona pellucida var blevet boret med enucleationspipetten (ca. 10 μm indre diameter) ved påføring af nogle få piezoimpulser , blev dens spids ført frem, indtil den nåede den gennemskinnelige plet i ooplasmaet. Det gennemskinnelige ooplasma (med kromosomer i metafase II) blev suget ind i pipetten uden at bryde plasmamembranen og blev forsigtigt trukket væk fra oocytten, indtil en strakt cytoplasmisk bro blev afklemt. Som vurderet ved fiksering og farvning af oocyterne eller farvning med Hoechst 33342 var effektiviteten af enucleation 100 %.
Identifikation af “levende” og “døde” første polære legemer
Oviduktale oocytter blev indsamlet fra B6D2F1-, CD1- og C3H-hunner mellem 13 og 27 h efter hCG-injektion. Polarlegemernes levedygtighed blev vurderet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt celleviabilitetstestsæt (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), der skelner mellem plasmamembranintakte (“levende”) og beskadigede (“døde”) celler i henhold til fluorescensfarvningsmønsteret under et UV-mikroskop. Kromosomerne i levende polarlegemer med intakte plasmamembraner fluorescerede grønt, mens kromosomerne i døde polarlegemer fluorescerede klart orangerødt. Resultaterne af vores primære observationer viste, at alle levende polarlegemer havde en skarpt defineret, glat membran og et klart cytoplasma (fig. 1A). Deres kromosomer var spredte, strakte eller klæbede til hinanden. Nogle døde polære legemer havde en glat plasmamembran, men hos de fleste var membranen ru eller manglede den. Det lettest genkendelige træk ved det døde pollegeme var et meget granuleret cytoplasma, uanset plasmamembranernes og kromosomernes tilstand (Fig. 1B).
Live (A) og døde (B) pollegemer (pile) (pile) set med interferenskontrastoptik. A′, B′) Samme som ovenfor, men set med fase-kontrastoptik. Levende polarlegemer med intakte plasmamembraner har relativt klart cytoplasma, mens døde polarlegemer med ødelagte eller manglende plasmamembraner har granulært cytoplasma.
Live (A) og døde (B) polarlegemer (pile) set med interferenskontrastoptik. A′, B′) Samme som ovenfor, men set med fase-kontrastoptik. Levende pollegemer med intakte plasmamembraner har relativt klart cytoplasma, mens døde pollegemer med ødelagte eller manglende plasmamembraner har granulært cytoplasma.
Transfer af første pollegemers kromosomer til enukleerede oocytter og efterfølgende sædinjektion
Teknikken til transfer og injektion svarede til den teknik, der anvendes til injektion af sædkerner fra spermatoder i oocytter . En oocyt med et levende første polarlegeme blev udvalgt, og dens zona pellucida blev boret med en piezo-drevet injektionspipette. Plasmamembranen i pollegemet blev brudt ved at suge det ind i pipetten. Hele indholdet af det ødelagte pollegeme blev straks injiceret i en enukleeret oocyt. I en separat forsøgsserie blev hele indholdet af et dødt pollegeme injiceret. Oocytter med polarlegemer injiceret blev inkuberet i CZB i 2 timer ved 37,5 °C under 5 % CO2 i luft før en anden injektion af en spermatozoon. Umiddelbart før sædinjektionen blev de enkelte sædceller halshugget ved at påføre nogle få piezoimpulser på halsregionen. Et enkelt sædhoved blev injiceret i hver oocyt som beskrevet af Kuretake et al. bortset fra, at operationen blev udført ved stuetemperatur (23-25°C) i stedet for ved 17-18°C.
Oocytundersøgelse og embryooverførsel
Nogle oocytter blev undersøgt mellem 10 min og 2 h efter injektion for at bestemme, hvordan polære kropskromosomer opførte sig i oocyttens cytoplasma. Andre oocytter blev undersøgt 5-6 timer senere for at undersøge forekomsten af normal befrugtning. De med et andet polarlegeme og to pronukler blev betragtet som normalt befrugtede og blev dyrket i CZB natten over. Normale embryoner i 2-celle-stadiet blev derefter overført til ovidukterne hos modtagerhunner, der var blevet parret med vasektomerede hanner i løbet af den foregående nat.
I en række forsøg blev C3H-mus anvendt som pollegemsdonorer. Alle modtageroocytter og -sædceller var fra B6D2F1-mus. C3H-mus er homologe med hensyn til fire hårfarvegener, A (agouti), B (brun), C (albino) og D (fortyndet), dvs. A/A,B/B,C/C,D/D. B6D2F1-mus er a/a,B/b,C/C,D/d. Hvis enucleation af B6D2F1-oocytter var mislykkedes, og de var blevet befrugtet af B6D2F1-sædceller, ville pelsen hos alle afkom have været sort (a/a,B/+,C/C,D/+), brun (a/a,b/b,C/C,D/+) og grå (a/a,+/+,C/C,d/d), men ikke agouti eller hvid i farven. Hvis kun C3H polarlegemskromosomer og B6D2F1 sædkromosomer havde deltaget i udviklingen af enukleerede oocytter, ville alle afkom forventes at have agouti-pels (A/a,B/+,C/C,D/+).
På den 19. dag postcoitum blev modtagerhunner uden tydelige tegn på drægtighed aflivet, og deres uterus blev undersøgt for tilstedeværelse af fostre. Kejsersnit var nødvendigt, fordi en recipienthun, der bar ≤ 2 fostre, ikke var i stand til at føde selv. Eventuelle levende fostre blev opdrættet af ammende CD1 (albino)-plejehunner med mælk. Andre hunner fik lov til at føde og opfostre deres afkom.
Resultater
Figur 2 viser andelen af levedygtige første polkroppe på forskellige tidspunkter efter hCG-injektion. Da ægløsning hos musen finder sted mellem 10 og 14 timer efter hCG-injektion , synes de fleste første pollegemer at være degenereret før eller kort efter ægløsningen. Ikke desto mindre var 5-15% af pollegemerne levedygtige i mange timer efter ægløsning.
Procentdele af levende pollegemer på forskellige tidspunkter efter ægløsning i en hybridstamme (B6D2F1), en udadvendt stamme (CD-1) og en indavlet stamme (C3H) af musen.
Procentdele af levende pollegemer på forskellige tidspunkter efter ægløsning i en hybridstamme (B6D2F1), en uddavlet stamme (CD-1) og en indavlet stamme (C3H) af mus.
Når et levende første pollegeme blev injiceret i en enukleeret oocyt, aggregerede pollegemekromosomerne gradvist (fig. 3, A og B). Senest 2 timer efter injektionen var kromosomerne arrangeret på metafasepladen i den anden meiotiske deling (Fig. 3C). Kromosomer i døde polkroppe blev aldrig omdannet til typiske metafase-kromosomer (Fig. 3D).
Transformation af de første polkroppekromosomer til metafase II-kromosomer i enukleerede oocytter. A) Kort efter injektion i oocytten; kromosomerne er spredte. B, C) Kromosomer aggregeres gradvist og er arrangeret på metafasepladen 2 timer efter injektion. D) Kromosomer i det døde pollegeme, der er injiceret i oocytten, kan ikke organiseres til at danne kromosom-spindelkompleks.
Transformation af de første pollegeme-kromosomer til metafase II-kromosomer i enukleerede oocytter. A) Kort efter injektion i oocytten; kromosomerne er spredte. B, C) Kromosomer aggregeres gradvist og er arrangeret på metafasepladen 2 timer efter injektion. D) Kromosomer i det døde pollegeme, der er injiceret i oocytten, kan ikke organiseres til at danne kromosom-spindelkompleks.
Når i alt 171 enukleerede oocytter blev injiceret med levende første pollegemer, overlevede ca. halvdelen (tabel 1). Efter injektion af en enkelt sædcelle (Fig. 4A) blev størstedelen af oocyterne befrugtet normalt (Fig. 4B), uanset pollegemernes postovulatoriske alder (Tabel 1). Overførsel af 74 tocellede embryoner til 11 plejemødre resulterede i fødslen af 27 normale afkom (tabel 1). Af disse blev 3 født ved kejsersnit af to hunner. De øvrige blev født naturligt. Alle 27 afkom blev opdrættet, og der blev foretaget parring mellem dem. Alle 15 hunner blev drægtige og fik kuld af normal størrelse (8-12).
Udvikling af enukleerede oocytter fra mus, der er injiceret med første polære kropskromosomer (Pb1c) og spermatozoer.
| Kilde til Pb1c . | Tidspunkt efter hCG-injektion, hvor Pb1c blev indsamlet . | Antal enukleerede oocytter . | Antal overførte 2-cellede embryoner (antal plejemødre) . | Antal levende afkom (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Total . | Soverlevende efter Pb1c-injektion (%) . | Normalt befrugtet efter sædinjektion . | ||||
| 30 | 28 (6) | 16 (57) | ||||
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | |||
| C3H | 25 | |||||
| Kilde til Pb1c . | Tidspunkt efter hCG-injektion, hvor Pb1c blev indsamlet . | Antal enukleerede oocytter . | Antal overførte 2-cellede embryoner (antal plejemødre) . | Antal levende afkom (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Total . | Soverlevende efter Pb1c-injektion (%) . | Normalt befrugtet efter sædinjektion . | ||||
| 28 (6) | ||||||
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | 36 (3) | 18 (50) | |
| C3H | ||||||
Udvikling af enukleerede oocytter fra mus, der er injiceret med de første polære kropskromosomer (Pb1c) og spermatozoer.
| Kilde til Pb1c . | Tidspunkt efter hCG-injektion, hvor Pb1c blev indsamlet . | Antal enukleerede oocytter . | Antal overførte 2-cellede embryoner (antal plejemødre) . | Antal levende afkom (%) . | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Total . | Soverlevende efter Pb1c-injektion (%) . | Normalt befrugtet efter sædinjektion . | |||||
| 30 | 28 (6) | 16 (57) | |||||
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | ||||
| C3H | 25 | ||||||
| Kilde til Pb1c . | Tidspunkt efter hCG-injektion, hvor Pb1c blev indsamlet . | Antal enukleerede oocytter . | Antal overførte 2-cellede embryoner (antal plejemødre) . | Antal levende afkom (%) . | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Total . | Soverlevende efter Pb1c-injektion (%) . | Normalt befrugtet efter sædinjektion . | ||||
| 30 | 28 (6) | 16 (57) | ||||
| 20 h | 85 | 41 (48) | 39 | 36 (3) | ||
| 10 | 10 | 10 (2) | 3 (30) | |||
Fertilisering af oocyt med de første pollegemiske kromosomer i stedet for dens egne kromosomer. A) Denne oocyt blev enucleeret, og derefter blev de første polarlegemskromosomer overført og derefter injiceret med et sædhoved. Dette fotografi blev taget ca. 10 min. efter sædcelleinjektion; en pil angiver et sædcellehoved i oocytten; c angiver kromosomer af det første pollegemes oprindelse. B) En oocyt (æg) 5 timer efter sædinjektion med to pronukler og et (andet) pollegeme (pil).
Fertilisering af oocyt med de første pollegemskromosomer i stedet for dens egne kromosomer. A) Denne oocyt blev enucleeret, og derefter blev de første polarlegemskromosomer overført og derefter injiceret med et sædhoved. Dette fotografi blev taget ca. 10 min. efter sædcelleinjektion; en pil angiver et sædcellehoved i oocytten; c angiver kromosomer af det første pollegemes oprindelse. B) En oocyt (æg) 5 timer efter sædinjektion med to pronukler og et (andet) pollegeme (pil).
Diskussion
De foreliggende resultater viser, at kromosomer inden for det første pollegeme har samme genetiske og reproduktive potentiale som dem, der er tilbage i oocytten efter den første meiotiske deling. Kromosomer inden for døde pollegemer blev ikke organiseret efter injektion i oocytter. Kromosomer i levende polarlegemer blev spredt, strakt eller aggregeret. Vi ved ikke, om der er en årsagssammenhæng mellem kromosomernes tilstand i pollegemet og succes/fiasko for den embryonale udvikling efter injektion.
Under normale forhold degenererer musens første pollegeme ret hurtigt. Ifølge Evsikov og Evsikov , degenererer mere end halvdelen inden for få timer efter ægløsning, og langt de fleste opløses i løbet af de næste 12 timer. Hos mennesker er der derimod mange første pollegemer vedvarende i mere end 20 timer efter ægløsning . Generelt har det første pollegeme hos eutheriske pattedyr dog en kortere levetid end det andet pollegeme. Selv om degeneration af pollegemer (og også af ubefrugtede oocytter) sandsynligvis er en apoptotisk proces , forstår man ikke de faktorer, der bestemmer de individuelle og artsforskelle i degenerationshastighederne for pollegemer (og ubefrugtede oocytter).
Som vist her er levende kromosomer fra første pollegeme i stand til at gennemgå den anden meiose efter overførsel til modne oocytter uanset deres postovulatoriske alder. Beskadigede polarlegemskromosomer, som vist af Rodman , er tilsyneladende ikke i stand til at gøre det. Således kan kromosomer i levende pollegemer, der er bestemt til at degenerere, reddes ved at blive overført til ooplasmaet.
Raten af oocytoverlevelse efter injektion af pollegemer var ikke særlig høj (se tabel 1), måske på grund af injektionspipettens store størrelse. Oocytoverlevelsesraten kan sandsynligvis øges gennem tekniske forbedringer. Desuden har musens oocyt (ca. 75 μm i diameter) et relativt stort pollegeme (ca. 10 μm i diameter). Mikrokirurgisk operation som rapporteret her vil sandsynligvis vise sig at være lettere, når polarlegemer er mindre i forhold til oocyttens størrelse, som f.eks. hos dyr (f.eks. kvæg) og hos mennesker.
Og selv om det teknisk set er vanskeligere end blastomer-kromosomanalyser på grund af polarlegemers mindre størrelse, er polarlegemer-kromosomanalyser blevet anvendt i vid udstrækning til genetisk diagnose før konceptionen hos mennesker . Da polarlegemer er let tilgængelige, vil genetisk diagnose ved hjælp af polarlegemer fortsat være værdifuld, hvis vi holder os mulige faldgruber for øje . For forsøgsdyr vil genetisk diagnose ved hjælp af polære legemer være nyttig ved markørstøttet udvælgelse af hunlige gameter og identifikation af f.eks. transgene oocytter .
Da det nu er muligt at anvende både det første og det andet polære legeme til produktion af fertile afkom, kan den genetiske information i én oocyt overføres til fire afkom (fig. 5). Da donoroocytter enucleeres før overførsel af kromosomer fra pollegemet, vil alle afkom ikke få anden genetisk påvirkning fra oocytdonorer end fra moderens (oocyt) mitokondrier. Da hver oocyt modtager en anden sædcelle, er der ikke tale om kloning ved denne form for reproduktion. Fire oocytter modtager forskellige moderlige og faderlige gener. I en ekstrem situation, hvor der kun er få hunner af en art tilbage, kan brugen af pollegemer på denne måde bidrage til at øge den genetiske diversitet i afkommet, forudsat at oocytter af nært beslægtede arter er let tilgængelige.
Dette diagram illustrerer produktionen af fire afkom ved hjælp af kromosomerne fra en enkelt oocyt. Det første polære legeme fra oocyt A fra dyr 1 (farvet) overføres til oocyt C fra dyr 2 (albino), som er blevet enucleeret. Her henviser tallet (2n, n) til kromosomernes ploiditet og ikke til centromerens antal i sig selv. Efter at de første polarlegemskromosomer (PB I) er blevet omdannet til kromosomer i metafase II, injiceres et enkelt sædhoved. Denne oocyt aktiveres, danner to pronuclei og det andet polære legeme (PB II) og udvikler sig til sidst til afkom C. Oocyt D er først enukleeret og derefter injiceret med et enkelt sædhoved. Efter at sædhovedet er blevet omdannet til en pronukleus i den aktiverede oocyt, injiceres et andet polært legeme fra oocyt C. Denne oocyt udvikler sig til afkom D. Afkom A udvikles fra oocyt A fra dyr 1. Afkom B produceres ved at overføre det andet pollegeme fra oocyt A til oocyt B med kun sædcellens pronukleus.
Dette diagram illustrerer produktionen af fire afkom ved hjælp af kromosomerne fra en enkelt oocyt. Det første polære legeme fra oocyt A fra dyr 1 (farvet) overføres til oocyt C fra dyr 2 (albino), som er blevet enucleeret. Her henviser tallet (2n, n) til kromosomernes ploiditet og ikke til centromerens antal i sig selv. Efter at de første polarlegemskromosomer (PB I) er blevet omdannet til kromosomer i metafase II, injiceres et enkelt sædhoved. Denne oocyt aktiveres, danner to pronuclei og det andet polære legeme (PB II) og udvikler sig til sidst til afkom C. Oocyt D er først enukleeret og derefter injiceret med et enkelt sædhoved. Efter at sædhovedet er blevet omdannet til en pronukleus i den aktiverede oocyt, injiceres et andet polært legeme fra oocyt C. Denne oocyt udvikler sig til afkom D. Afkom A udvikles fra oocyt A fra dyr 1. Afkom B produceres ved at overføre det andet polære legeme fra oocyt A til oocyt B med kun sædpronukleus.
Anerkendelser
Særlig tak til Dr. J. Michael Bedford for at have gennemgået en tidlig version af manuskriptet. Vi takker fru Charlotte Oser for hendes hjælp ved udarbejdelsen af manuskriptet.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
.
.
; Abstract P-050.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
:
;
:
.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
,
,
,
.
.
;
:
–
.
.
.
;
:
–
.
.
.
;
:
.
,
,
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
.
.
;
:
–
.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
;
:
–
.
.
.
;
:
–
.
,
,
.
.
;
:
–
.
Author notes
Støttet af NIH-tilskud (HD-03402 og HD-34362). T.W. var modtager af et postdoc-stipendium fra Japanese Association of Promotion of Science.