Primul corp polar poate fi folosit pentru producerea de descendenți normali la șoareci1

Abstract

Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă cromozomii din primul corp polar pot participa la dezvoltarea embrionară normală. La șoarece, majoritatea primilor corpuri polare degenerează la scurt timp după ovulație, dar câteva rămân viabile timp de 10 h sau mai mult. Atunci când conținutul unui corp polar viu a fost injectat într-un ovocit matur enucleat și examinat 2 ore mai târziu, cromozomii din corpul polar erau dispuși pe o placă metafazică, așa cum se observă înainte de diviziunea meiotică secundară. Astfel de ovocite au fost fertilizate în mod normal prin injectarea de spermatozoizi. Atunci când embrionii cu 2 celule au fost transferați la femele adoptive, 30-57% dintre aceștia s-au dezvoltat în descendenți fertili. Acest rezultat susține o convingere de lungă durată conform căreia cromozomii ejectați în primul corp polar au același potențial genetic ca și cei rămași în oocit după prima diviziune meiotică. Deoarece se știe că cromozomii din al doilea corp polar au potențialul deplin de a participa la dezvoltarea embrionară normală, este teoretic posibil să se reproducă patru descendenți prin utilizarea cromozomilor dintr-un singur ovocit.

Introducere

Ovocitul primar al mamiferelor emite primul corp polar înainte de ovulație. Al doilea corp polar este extrudat din ovocit ca urmare a activării ovocitului declanșată de spermatozoidul fertilizator. În mod normal, cromozomii din primul și al doilea corp polar degenerează fără a contribui la dezvoltarea embrionară. Speculația conform căreia cromozomii din corpul polar au același potențial genetic ca și cromozomii lor surori rămași în oocit a fost dovedită experimental de Wakayama et al. și Feng și Hall , care au obținut urmași vii de șoareci prin fuzionarea celui de-al doilea corp polar cu ovule fertilizate din care fuseseră îndepărtați pronucleii femelei. Noi raportăm aici că cromozomii din primul corp polar sunt, de asemenea, capabili să participe la dezvoltarea embrionară normală dacă li se permite să finalizeze a doua diviziune meiotică în cadrul unui ovul enucleat, apoi li se permite să se amestece cu cromozomii unui spermatozoid injectat.

Materiale și metode

Animale

Soareci femele B6D2F1 (negre), în vârstă de 8-10 săptămâni, au fost folosiți ca donatori de ovocite și corpuri polare. Femelele C3H (agouti; în vârstă de 10 săptămâni) și femelele CD1 (albinoase; în vârstă de 10-15 săptămâni) au fost, de asemenea, utilizate ca donatoare de corpuri polare. Spermatozoizii au fost colectați din epididimidele caudate ale masculilor B6D2F1, în vârstă de 10 săptămâni. Mamele adoptive au fost femele CD1. Animalele utilizate în acest studiu au fost întreținute în conformitate cu liniile directoare ale Serviciului pentru animale de laborator de la Universitatea din Hawaii și cu cele elaborate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al Institutului de resurse de laborator al Consiliului Național de Cercetare (publicația DHEW nr. 80-23, revizuită în 1985). Protocolul manipulării și tratamentelor noastre cu animale a fost revizuit și aprobat de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea din Hawaii.

Mediu

Ovocitele și ovulele fertilizate au fost cultivate într-un mediu CZB tamponat cu bicarbonat la 37,5°C, cu 5% CO2 în aer. Toate manipulările ovocitelor au fost efectuate în CZB tamponat cu Hepes (Hepes-CZB) la temperatura camerei (23-25°C în aer). pH-ul ambelor medii a fost de aproximativ 7,4,

Micromanipulare

Pipetinele de menținere și injectare a ovocitelor au fost pregătite conform Hogan et al. cu excepția faptului că vârful pipetei de injectare a fost lăsat la același nivel după rupere. Diametrul interior al acestei pipete la vârf a fost de aproximativ 10 μm pentru enuclearea ovocitelor și de 7-8 μm pentru aspirarea și injectarea primului corp polar. Pipeta de injecție a fost atașată la o unitate piezoelectrică de acționare a pipetei (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japonia). Perforarea zonei pellucide și injectarea corpului polar (sau a unui spermatozoid) în ovocite au fost efectuate așa cum s-a descris anterior .

Prepararea ovocitelor receptoare

Femele B6D2F1 au fost superovulate prin injecții consecutive de eCG (5 UI) și hCG (5 UI) la 48 de ore distanță. La aproximativ 14 h după injectarea hCG, complexele ovocit-cumulus au fost eliberate din oviduct în Hepes-CZB. Celulele cumulative au fost dispersate prin tratament de 5 minute cu 0,1% hialuronidază testiculară bovină (300 unități USP/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) în Hepes-CZB. Ovocitele fără cumulus au fost păstrate în CZB la 37,5°C la 5% CO2 în aer timp de mai puțin de 1 h înainte de alte tratamente.

Enuclearea ovocitelor receptoare

Enuclearea ovocitelor mature a fost efectuată în Hepes-CZB conținând 5 μg/ml de citochalasină B . Ovocitele au fost menținute în acest mediu timp de aproximativ 10 minute (25°C) înainte de enucleare. Un ovocit, ținut de o pipetă de fixare, a fost rotit până la detectarea unei pete ooplasmatice mici, translucide – locul unde se află cromozomii din metafaza II. După ce zona pellucida a fost găurită cu pipeta de enucleare (cu un diametru interior de aproximativ 10 μm) prin aplicarea câtorva impulsuri piezoelectrice , vârful acesteia a fost avansat până când a ajuns la pata translucidă din ooplasmă. Ooplasma translucidă (cu cromozomi în metafaza II) a fost aspirată în pipetă fără a se rupe membrana plasmatică și a fost îndepărtată ușor de oocit până când o punte citoplasmatică întinsă a fost ciupită. După cum a fost evaluată prin fixarea și colorarea ovocitelor sau prin colorarea cu Hoechst 33342, eficiența enucleării a fost de 100%.

Identificarea primilor corpuri polare „vii” și „morți”

Ovocitele oviductale au fost colectate de la femele B6D2F1, CD1 și C3H între 13 și 27 h după injectarea hCG. Viabilitatea corpurilor polare a fost evaluată cu ajutorul unui kit de testare a viabilității celulare disponibil în comerț (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) care face diferența între celulele cu membrana plasmatică intactă („vii”) și cele deteriorate („moarte”) în funcție de modelul de colorare a fluorescenței la un microscop UV. Cromozomii din corpurile polare vii cu membrane plasmatice intacte au devenit verzi, în timp ce cei din corpurile polare moarte au devenit roșu-portocaliu aprins. Rezultatele observațiilor noastre primare au arătat că toate corpurile polare vii aveau o membrană bine definită, netedă și o citoplasmă clară (Fig. 1A). Cromozomii lor erau împrăștiați, întinși sau aderenți unii la alții. Unele corpuri polare moarte aveau o membrană plasmatică netedă, dar în majoritatea lor membrana era aspră sau lipsea. Caracteristica cea mai ușor de recunoscut a corpului polar mort a fost citoplasma foarte granulată, indiferent de starea membranelor plasmatice și a cromozomilor (Fig. 1B).

Când un prim corp polar viu a fost injectat într-un ovocit enucleat, cromozomii corpului polar s-au agregat treptat (Fig. 3, A și B). La 2 h după injectare, cromozomii au fost aranjați pe placa de metafază a celei de-a doua diviziuni meiotice (Fig. 3C). Cromozomii din corpurile polare moarte nu s-au transformat niciodată în cromozomi tipici de metafază (Fig. 3D).

Când un total de 171 de ovocite enucleate au fost injectate cu primii corpuri polare vii, aproximativ jumătate au supraviețuit (tabelul 1). După injectarea unui singur spermatozoid (Fig. 4A), majoritatea ovocitelor au fost fecundate în mod normal (Fig. 4B), indiferent de vârsta postovulatorie a corpurilor polare (Tabelul 1). Transferul a 74 de embrioni cu două celule la 11 mame adoptive a dus la nașterea a 27 de descendenți normali (tabelul 1). Dintre aceștia, 3 s-au născut prin cezariană de la două femele. Ceilalți au fost născuți pe cale naturală. Toți cei 27 de descendenți au fost crescuți și s-a efectuat împerecherea între ei. Toate cele 15 femele au rămas gestante și au avut pui de mărime normală (8-12).

Discuție

Rezultatele prezente arată că cromozomii din cadrul primului corp polar au același potențial genetic și de reproducere ca și cei rămași în ovocit după prima diviziune meiotică. Cromozomii din interiorul corpurilor polare moarte nu s-au organizat după injectarea în ovocite. Cromozomii din corpurile polare vii au fost împrăștiați, întinși sau agregate. Nu știm dacă există o relație de cauzalitate între starea cromozomilor din interiorul corpului polar și succesul/nereușita dezvoltării embrionare după injectare.

În condiții normale, primul corp polar al șoarecelui degenerează destul de repede. Potrivit lui Evsikov și Evsikov , mai mult de jumătate degenerează în câteva ore după ovulație, iar marea majoritate se dezintegrează în următoarele 12 h. La om, în schimb, multe dintre primele corpuri polare persistă mai mult de 20 h după ovulație . Cu toate acestea, în general, primul corp polar la mamiferele euteriene are o viață mai scurtă decât cel de-al doilea corp polar. Deși degenerarea corpurilor polare (și a ovocitelor nefertilizate, de asemenea) este probabil să fie un proces apoptotic , factorii care determină diferențele individuale și între specii în ceea ce privește ratele de degenerare a corpurilor polare (și a ovocitelor nefertilizate) nu sunt înțeleși.

După cum se arată aici, cromozomii vii din primul corp polar sunt capabili să treacă prin a doua meioză după transferul în ovocitele mature, indiferent de vârsta lor postovulatorie. Cromozomii de corp polar deteriorați, așa cum a arătat Rodman , sunt aparent incapabili să facă acest lucru. Astfel, cromozomii din corpurile polare vii care sunt destinați să degenereze pot fi salvați prin transfer în ooplasmă.

Rata de supraviețuire a ovocitelor după injectarea corpului polar nu a fost foarte mare (a se vedea tabelul 1), poate din cauza dimensiunii mari a pipetei de injectare. Rata de supraviețuire a ovocitelor poate fi probabil crescută prin îmbunătățiri tehnice. Mai mult, ovocitele de șoarece (aproximativ 75 μm în diametru) au un corp polar relativ mare (aproximativ 10 μm în diametru). Operația microchirurgicală raportată aici se va dovedi probabil mai ușoară atunci când corpurile polare sunt mai mici în raport cu dimensiunea ovocitelor, cum ar fi la animale (de exemplu, bovine) și la oameni.

Deși din punct de vedere tehnic este mai dificilă decât analizele cromozomiale ale blastomerilor din cauza dimensiunii mai mici a corpurilor polare , analizele cromozomiale ale corpurilor polare au fost utilizate pe scară largă în diagnosticul genetic preconcepțional la oameni . Deoarece corpurile polare sunt disponibile cu ușurință, diagnosticul genetic folosind corpuri polare ar rămâne valoros dacă am ține cont de posibilele capcane . În cazul animalelor experimentale, diagnosticul genetic cu ajutorul corpurilor polare ar fi util în selecția asistată de markeri a gameților femelelor și în identificarea ovocitelor transgenice, de exemplu .

Din moment ce acum este posibilă utilizarea atât a primului cât și a celui de-al doilea corp polar pentru producerea de descendenți fertili, informația genetică dintr-un singur oocit poate fi transmisă la patru descendenți (Fig. 5). Deoarece ovocitele donatoare sunt enucleate înainte de transferul cromozomilor corpului polar, toți descendenții nu vor avea nicio influență genetică de la donatorii de ovocite, alta decât cea a mitocondriilor materne (ovocite). Deoarece fiecare oocit primește un spermatozoid diferit, acest mod de reproducere nu reprezintă o clonare. Patru ovocite primesc gene materne și paterne diferite. Într-o situație extremă în care rămân doar câteva femele ale unei specii, utilizarea corpurilor polare în acest mod ar putea contribui la creșterea diversității genetice a descendenților, cu condiția ca ovocitele unor specii înrudite să fie disponibile cu ușurință.

Recunoștințe

Se exprimă o apreciere specială doctorului J. Michael Bedford pentru revizuirea unei versiuni timpurii a manuscrisului. Mulțumim doamnei Charlotte Oser pentru ajutorul acordat în pregătirea manuscrisului.

Note ale autorului

.