The First Polar Body Can Be Used for the Production of Normal Offspring in Mice1

Abstract

Celem tego badania było określenie, czy chromosomy w pierwszym ciele polarnym mogą uczestniczyć w normalnym rozwoju embrionalnym. U myszy większość pierwszych ciałek polarnych degeneruje się wkrótce po owulacji, ale kilka z nich pozostaje żywotnych przez 10 lub więcej godzin. Gdy zawartość żywego ciałka polarnego wstrzyknięto do enukleowanego dojrzałego oocytu i zbadano 2 godziny później, chromosomy ciałka polarnego były ułożone na płytce metafazowej, tak jak to widać przed wtórnym podziałem mejotycznym. Takie oocyty zostały normalnie zapłodnione przez wstrzyknięcie spermy. Gdy dwukomórkowe embriony zostały przeniesione do samic zastępczych, 30-57% z nich rozwinęło się w płodne potomstwo. Wynik ten potwierdza długo utrzymujące się przekonanie, że chromosomy wyrzucone do pierwszego ciała polarnego mają taki sam potencjał genetyczny jak te, które pozostały w oocycie po pierwszym podziale mejotycznym. Ponieważ wiadomo, że chromosomy w drugim ciele polarnym mają pełny potencjał do uczestniczenia w normalnym rozwoju embrionalnym, teoretycznie możliwe jest odtworzenie czterech potomków przy użyciu chromosomów w jednym oocycie.

Wprowadzenie

Pierwotny oocyt ssaków wydziela pierwsze ciało polarne przed owulacją. Drugie ciało polarne jest wyciskane z oocytu w konsekwencji aktywacji oocytu, wywołanej przez plemnik zapładniający. Normalnie, chromosomy w obrębie zarówno pierwszego, jak i drugiego ciała polarnego degeneruj± się, nie przyczyniaj±c się do rozwoju embrionalnego. Spekulacje, że chromosomy ciałek polarnych maj± taki sam potencjał genetyczny jak ich siostrzane chromosomy pozostaj±ce w oocycie, zostały udowodnione eksperymentalnie przez Wakayamę i wsp. oraz Fenga i Halla, którzy uzyskali żywe potomstwo myszy przez fuzję drugich ciałek polarnych z zapłodnionymi jajami, z których usunięto żeńskie pronuklei. Tutaj donosimy, że chromosomy w pierwszym ciele polarnym są również zdolne do uczestniczenia w normalnym rozwoju embrionalnym, jeśli pozwoli się im ukończyć drugi podział mejotyczny w enukleowanym oocycie, a następnie pozwoli się im łączyć z chromosomami wstrzykniętego plemnika.

Materiały i metody

Zwierzęta

Samice myszy B6D2F1 (czarne), w wieku 8-10 tyg. zostały użyte jako dawcy oocytów i ciałek polarnych. Samice C3H (agouti; 10 wk old) i CD1 (albinos; 10-15 wk old) były również używane jako dawcy ciałek polarnych. Plemniki pobrano z najądrzy ogoniastych samców B6D2F1 w wieku 10 tyg. Matkami zastępczymi były samice CD1. Zwierzęta użyte w tym badaniu były utrzymywane zgodnie z wytycznymi Laboratory Animal Service na Uniwersytecie Hawajskim oraz z wytycznymi przygotowanymi przez Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Resources National Research Council (publikacja DHEW nr 80-23, zmieniona w 1985 r.). Protokół naszego postępowania ze zwierzętami i zabiegów został przejrzany i zatwierdzony przez Animal Care and Use Committee na University of Hawaii.

Media

Oocyty i zapłodnione jaja hodowano w buforowanym wodorowęglanem podłożu CZB w temperaturze 37,5°C pod 5% CO2 w powietrzu. Wszystkie manipulacje z oocytami przeprowadzono w buforowanej Hepesem pożywce CZB (Hepes-CZB) w temperaturze pokojowej (23-25°C) w powietrzu. pH obu mediów wynosiło około 7,4.

Mikromanipulacja

Pipety do przytrzymywania i wstrzykiwania oocytów przygotowano zgodnie z Hogan i wsp. z wyjątkiem tego, że końcówkę pipety do wstrzykiwania pozostawiono płaską po złamaniu. Wewnętrzna średnica tej pipety na jej końcu wynosiła około 10 μm do enukleacji oocytów i wynosiła 7-8 μm do zasysania i wstrzykiwania pierwszego ciała polarnego. Pipeta iniekcyjna była podłączona do piezoelektrycznego urządzenia napędzającego pipetę (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japonia). Wiercenie zony pellucida i wstrzykiwanie ciałka polarnego (lub plemnika) do oocytów przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem.

Preparation of Recipient Oocytes

B6D2F1 samice były superowulowane przez kolejne wstrzyknięcia eCG (5 IU) i hCG (5 IU) w odstępie 48 h. Około 14 h po iniekcji hCG, kompleksy oocyt-komórka cumulusowa były uwalniane z jajowodów do Hepes-CZB. Komórki cumulusowe były rozpraszane przez 5-minutowe traktowanie 0,1% hialuronidazą z jąder bydlęcych (300 USP jednostek/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) w Hepes-CZB. Oocyty pozbawione cumulusów przechowywano w CZB w temperaturze 37,5°C pod 5% CO2 w powietrzu przez mniej niż 1 h przed dalszymi zabiegami.

Enukleacja oocytów biorców

Enukleację dojrzałych oocytów przeprowadzono w Hepes-CZB zawierającym 5 μg/ml cytochalazyny B . Oocyty przed enukleacją przetrzymywano w tym medium przez około 10 min (25°C). Oocyt, przytrzymywany pipetą, obracano do momentu wykrycia małej, półprzezroczystej plamki ooplazmatycznej – miejsca występowania chromosomów metafazy II. Po przewierceniu zony pellucida pipetą enukleacyjną (o średnicy wewnętrznej ok. 10 μm) poprzez zastosowanie kilku impulsów piezoelektrycznych, jej końcówka była przesuwana aż do osiągnięcia półprzezroczystej plamki w ooplazmie. Półprzezroczysta ooplazma (z chromosomami metafazy II) była zasysana do pipety bez przerwania błony plazmatycznej i delikatnie odciągana od oocytu aż do oderwania rozciągniętego mostka cytoplazmatycznego. Jak oceniono przez utrwalanie i barwienie oocytów lub barwienie Hoechst 33342, wydajność enukleacji wynosiła 100%.

Identyfikacja „żywych” i „martwych” pierwszych ciałek polarnych

Oocyty jajowodowe pobrano od samic B6D2F1, CD1 i C3H między 13 a 27 h po wstrzyknięciu hCG. Żywotność ciałek polarnych oceniano przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do testowania żywotności komórek (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), który rozróżnia komórki z nienaruszoną błoną plazmatyczną („żywe”) i uszkodzone („martwe”) zgodnie ze wzorem barwienia fluorescencyjnego pod mikroskopem UV. Chromosomy w żywych ciałkach polarnych z nienaruszoną błoną plazmatyczną fluoryzowały na zielono, podczas gdy te w martwych ciałkach polarnych fluoryzowały na jasno pomarańczowo-czerwono. Wyniki naszych pierwotnych obserwacji wykazały, że wszystkie żywe ciałka polarne miały ostro odgraniczoną, gładką błonę i przejrzystą cytoplazmę (Rys. 1A). Ich chromosomy były rozproszone, rozciągnięte lub przylegające do siebie. Niektóre martwe ciała polarne miały gładką błonę plazmatyczną, ale u większości błona była szorstka lub nie było jej wcale. Najłatwiejszą do rozpoznania cechą martwego ciała polarnego była bardzo ziarnista cytoplazma, niezależnie od stanu błony plazmatycznej i chromosomów (Ryc. 1B).

Transfer pierwszych chromosomów ciała polarnego do enukleowanych oocytów i późniejsze wstrzykiwanie plemników

Technika transferu i wstrzykiwania była podobna do tej stosowanej do wstrzykiwania jąder plemników do oocytów. Wybrano oocyt z żywym pierwszym ciałem polarnym, a jego zona pellucida została przewiercona pipetą iniekcyjną z napędem piezoelektrycznym. Błona plazmatyczna ciałka polarnego została przerwana przez zassanie go do pipety. Cała zawartość rozbitego ciała polarnego była natychmiast wstrzykiwana do enukleowanego oocytu. W osobnej serii eksperymentów wstrzykiwano całą zawartość martwego ciała polarnego. Oocyty z ciałkiem polarnym były inkubowane w CZB przez 2 godziny w temperaturze 37,5°C pod wpływem 5% CO2 w powietrzu przed drugą iniekcją plemnika. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem spermy, pojedyncze plemniki były dekapitowane przez zastosowanie kilku impulsów piezoelektrycznych w okolicy szyi. Pojedyncza główka plemnika była wstrzykiwana do każdego oocytu, tak jak opisali to Kuretake i wsp. z tą różnicą, że operacja była wykonywana w temperaturze pokojowej (23-25°C), a nie w 17-18°C.

Oocyte Examination and Embryo Transfer

Niektóre oocyty były badane pomiędzy 10 min a 2 h po wstrzyknięciu, aby określić jak zachowywały się chromosomy ciała polarnego w cytoplazmie oocytu. Inne oocyty były badane 5-6 h później pod kątem występowania normalnego zapłodnienia. Te z jednym drugim ciałem polarnym i dwoma pronukleami uznawano za normalnie zapłodnione i hodowano w CZB przez noc. Regularne 2-komórkowe zarodki były następnie przenoszone do jajowodów samic-biorców, które były kojarzone z wazektomizowanymi samcami podczas poprzedniej nocy.

W serii eksperymentów, myszy C3H były używane jako dawcy ciałek polarnych. Wszystkie oocyty i plemniki biorców pochodziły od myszy B6D2F1. Myszy C3H są homologiczne w czterech genach koloru włosów, A (agouti), B (brązowy), C (albinos) i D (rozcieńczony), tj. A/A,B/B,C/C,D/D. Myszy B6D2F1 są a/a,B/b,C/C,D/d. Gdyby enukleacja oocytów B6D2F1 nie powiodła się i zostałyby one zapłodnione przez plemniki B6D2F1, sierść wszystkich potomków byłaby czarna (a/a,B/+,C/C,D/+), brązowa (a/a,b/b,C/C,D/+) i szara (a/a,+/+,C/C,d/d), ale nie agouti lub biała. Gdyby tylko chromosomy ciała biegunowego C3H i chromosomy plemnikowe B6D2F1 uczestniczyły w rozwoju enukleowanych oocytów, należałoby się spodziewać, że wszystkie potomstwa będą miały umaszczenie agouti (A/a,B/+,C/C,D/+).

W 19 dniu postcoitum, samice biorcy bez widocznych oznak ciąży zostały zabite, a ich macice zostały zbadane na obecność płodów. Cięcie cesarskie było konieczne, ponieważ samica biorczyni nosząca ≤ 2 płody nie była w stanie urodzić samodzielnie. Żywe płody, jeśli takie były, wychowywane były przez karmiące samice zastępcze CD1 (albinos). Pozostałym samicom pozwolono urodzić i wychować ich potomstwo.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia odsetek zdolnych do życia pierwszych ciałek polarnych w różnym czasie po wstrzyknięciu hCG. Ponieważ owulacja u myszy następuje pomiędzy 10 a 14 godzin± po wstrzyknięciu hCG, wydaje się, że większo¶ć pierwszych ciałek biegunowych zdegenerowała się przed lub wkrótce po owulacji. Niemniej jednak, 5-15% ciałek biegunowych było żywotnych przez wiele godzin po owulacji.

Gdy żywe pierwsze ciałko biegunowe wstrzykiwano do enukleowanego oocytu, chromosomy ciałka biegunowego ulegały stopniowej agregacji (Ryc. 3, A i B). Do 2 h po wstrzyknięciu, chromosomy były ułożone na płytce metafazowej drugiego podziału mejotycznego (Ryc. 3C). Chromosomy w martwych ciałach polarnych nigdy nie przekształciły się w typowe chromosomy metafazowe (Fig. 3D).

Gdy łącznie 171 enukleowanym oocytom wstrzyknięto żywe pierwsze ciała polarne, około połowa przeżyła (Tabela 1). Po wstrzyknięciu pojedynczego plemnika (Ryc. 4A), większość oocytów została normalnie zapłodniona (Ryc. 4B), niezależnie od postowulacyjnego wieku ciałek polarnych (Tabela 1). Transfer 74 dwukomórkowych embrionów do 11 matek zastępczych zaowocował urodzeniem 27 normalnych potomków (Tabela 1). Spośród nich, 3 urodziły się przez cesarskie cięcie dwie samice. Pozostałe urodziły się naturalnie. Wszystkie 27 potomków wychowano, a następnie przeprowadzono kojarzenie między nimi. Wszystkie 15 samic zaszło w ciążę i urodziło mioty normalnej wielkości (8-12).

Dyskusja

Prezentowane wyniki pokazują, że chromosomy w obrębie pierwszego ciała polarnego mają taki sam potencjał genetyczny i reprodukcyjny jak te pozostawione w oocycie po pierwszym podziale mejotycznym. Chromosomy w martwych ciałkach polarnych nie organizowały się po wstrzyknięciu do oocytu. Chromosomy w żywych ciałkach polarnych były rozproszone, rozciągnięte lub zagregowane. Nie wiemy, czy istnieje związek przyczynowy między stanem chromosomów w ciałku polarnym a sukcesem/porażką rozwoju embrionalnego po wstrzyknięciu.

W normalnych warunkach pierwsze ciałko polarne myszy degeneruje się dość szybko. Według Evsikov i Evsikov , ponad połowa degeneruje się w ciągu kilku godzin po owulacji, a ogromna większość rozpada się w ciągu następnych 12 h. U ludzi, dla kontrastu, wiele pierwszych ciałek polarnych utrzymuje się przez ponad 20 h po owulacji. Na ogół jednak, pierwsze ciało polarne u ssaków eutheryjskich ma krótszy żywot niż drugie ciało polarne. Chociaż degeneracja ciałek polarnych (a także niezapłodnionych oocytów) jest prawdopodobnie procesem apoptotycznym, to jednak czynniki, które decydują o indywidualnych i gatunkowych różnicach w szybkości degeneracji ciałek polarnych (i niezapłodnionych oocytów) nie są zrozumiałe.

Jak wykazano tutaj, żywe chromosomy pierwszego ciałka polarnego są zdolne do przechodzenia drugiej mejozy po przeniesieniu do dojrzałych oocytów, niezależnie od ich wieku postowulacyjnego. Uszkodzone chromosomy ciała polarnego, jak pokazano przez Rodman , są najwyraźniej niezdolne do tego. Tak więc chromosomy w obrębie żywych ciałek polarnych, które są przeznaczone do degeneracji, mogą być uratowane przez przeniesienie do ooplazmy.

Stopa przeżycia oocytów po wstrzyknięciu ciałek polarnych nie była zbyt wysoka (patrz Tabela 1), być może z powodu dużego rozmiaru pipety do wstrzykiwania. Współczynnik przeżywalności oocytów można prawdopodobnie zwiększyć poprzez ulepszenia techniczne. Co więcej, oocyt myszy (około 75 μm średnicy) ma stosunkowo duże ciało polarne (około 10 μm średnicy). Operacja mikrochirurgiczna, jak opisano tutaj, prawdopodobnie okaże się łatwiejsza, gdy ciała polarne są mniejsze w stosunku do wielkości oocytu, tak jak u zwierząt (np. Bydło) i u ludzi.

Chociaż technicznie trudniejsze niż analizy chromosomów blastomerów z powodu mniejszego rozmiaru ciał polarnych, analizy chromosomów ciała polarnego były szeroko stosowane w diagnostyce genetycznej przedkoncepcyjnej u ludzi. Ponieważ ciałka polarne są łatwo dostępne, diagnostyka genetyczna z wykorzystaniem ciałek polarnych byłaby nadal wartościowa, gdybyśmy pamiętali o możliwych pułapkach. W przypadku zwierząt doświadczalnych diagnostyka genetyczna z wykorzystaniem ciałek polarnych byłaby przydatna na przykład w selekcji gamet żeńskich wspomaganej markerami i identyfikacji oocytów transgenicznych .

Ponieważ obecnie możliwe jest wykorzystanie zarówno pierwszego, jak i drugiego ciałka polarnego do produkcji płodnego potomstwa, informacja genetyczna w jednym oocycie może być przekazana czterem potomkom (ryc. 5). Ponieważ oocyty dawczynie są enukleowane przed przeniesieniem chromosomów ciałka polarnego, wszystkie potomstwo nie będzie miało żadnego wpływu genetycznego od dawczyń oocytów, innego niż mitochondria matki (oocytu). Ponieważ każdy oocyt otrzymuje inny plemnik, ten sposób rozmnażania nie reprezentuje klonowania. Cztery oocyty otrzymują różne geny matczyne i ojcowskie. W skrajnej sytuacji, w której pozostaje tylko kilka samic danego gatunku, wykorzystanie ciałek polarnych w ten sposób może pomóc w zwiększeniu różnorodności genetycznej potomstwa, pod warunkiem, że oocyty blisko spokrewnionych gatunków są łatwo dostępne.

Podziękowania

Szczególne wyrazy uznania kierujemy do dr J. Michaela Bedforda za przejrzenie wczesnej wersji manuskryptu. Dziękujemy Pani Charlotte Oser za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Author notes

.