Der erste Polkörper kann für die Erzeugung normaler Nachkommen bei Mäusen verwendet werden1

Abstract

Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob Chromosomen im ersten Polkörper an der normalen Embryonalentwicklung beteiligt sein können. Bei der Maus degeneriert die Mehrheit der ersten Polkörper bald nach dem Eisprung, aber einige wenige bleiben 10 Stunden oder länger lebensfähig. Wenn der Inhalt eines lebenden Polkörpers in eine entkernte reife Eizelle injiziert und 2 Stunden später untersucht wurde, waren die Polkörperchromosomen auf einer Metaphasenplatte angeordnet, wie man sie vor der sekundären meiotischen Teilung sieht. Solche Eizellen wurden durch Spermieninjektion normal befruchtet. Bei der Übertragung von 2-Zellen-Embryonen auf weibliche Pfleglinge entwickelten sich 30-57 % zu fruchtbaren Nachkommen. Dieses Ergebnis stützt die seit langem bestehende Annahme, dass die in den ersten Polkörper ausgestoßenen Chromosomen das gleiche genetische Potenzial haben wie die nach der ersten meiotischen Teilung in der Eizelle verbleibenden. Da die Chromosomen im zweiten Polkörper bekanntermaßen das volle Potenzial haben, an der normalen Embryonalentwicklung teilzunehmen, ist es theoretisch möglich, mit den Chromosomen in einer Eizelle vier Nachkommen zu zeugen.

Einführung

Die primäre Eizelle des Säugetiers stößt den ersten Polkörper vor dem Eisprung aus. Der zweite Polkörper wird infolge der durch das befruchtende Spermium ausgelösten Oozytenaktivierung aus der Oozyte extrudiert. Normalerweise degenerieren die Chromosomen sowohl des ersten als auch des zweiten Polkörpers, ohne zur Embryonalentwicklung beizutragen. Die Spekulation, dass die Polkörperchromosomen das gleiche genetische Potenzial haben wie ihre in der Eizelle verbleibenden Schwesterchromosomen, wurde von Wakayama et al. und Feng und Hall experimentell nachgewiesen, die lebende Mäusenachkommen erhielten, indem sie die zweiten Polkörper mit befruchteten Eiern fusionierten, aus denen die weiblichen Vorkerne entfernt worden waren. Wir berichten hier, dass die Chromosomen des ersten Polkörpers auch an der normalen Embryonalentwicklung teilnehmen können, wenn man ihnen erlaubt, die zweite meiotische Teilung in einer entkernten Eizelle zu vollenden und sich dann mit den Chromosomen eines injizierten Spermatozoons zu vermischen.

Materialien und Methoden

Tiere

B6D2F1-Mausweibchen (schwarz), 8-10 Wochen alt, wurden als Spender von Eizellen und Polkörperchen verwendet. C3H-Weibchen (Agouti; 10 Wochen alt) und CD1-Weibchen (Albino; 10-15 Wochen alt) wurden ebenfalls als Polkörper-Spender verwendet. Die Spermien wurden aus den Nebenhoden von B6D2F1-Männchen im Alter von 10 Wochen gewonnen. Die Ziehmütter waren CD1-Weibchen. Die in dieser Studie verwendeten Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Labortierdienstes der Universität von Hawaii und den vom Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Instituts für Laborressourcen des Nationalen Forschungsrats (DHEW-Veröffentlichung Nr. 80-23, überarbeitet 1985) erstellten Richtlinien gehalten. Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde vom Ausschuss für die Pflege und den Einsatz von Tieren an der Universität von Hawaii geprüft und genehmigt.

Medien

Oozyten und befruchtete Eizellen wurden in einem bikarbonatgepufferten CZB-Medium bei 37,5°C und 5% CO2 in Luft kultiviert. Alle Eizellenmanipulationen wurden in Hepes-gepuffertem CZB (Hepes-CZB) bei Raumtemperatur (23-25°C) an der Luft durchgeführt. Der pH-Wert beider Medien betrug etwa 7,4.

Mikromanipulation

Die Pipetten zum Halten und Injizieren der Eizellen wurden nach Hogan et al. hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Spitze der Injektionspipette nach dem Abbrechen bündig gelassen wurde. Der Innendurchmesser dieser Pipette an der Spitze betrug etwa 10 μm für die Enukleation der Eizelle und 7-8 μm für das Ansaugen und Injizieren des ersten Polkörpers. Die Injektionspipette war an eine piezoelektrische Pipettenantriebseinheit (Prima Meat Packers, Tsuchiura, Japan) angeschlossen. Das Bohren der Zona pellucida und die Injektion des Polkörpers (oder eines Spermatozoons) in die Eizellen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Vorbereitung der Empfänger-Eizellen

B6D2F1-Weibchen wurden durch aufeinanderfolgende Injektionen von eCG (5 IE) und hCG (5 IE) im Abstand von 48 Stunden superovuliert. Etwa 14 Stunden nach der hCG-Injektion wurden die Eizellen-Kumulus-Komplexe aus den Eileitern in Hepes-CZB freigesetzt. Die Kumuluszellen wurden durch eine 5-minütige Behandlung mit 0,1 % boviner Hodenhyaluronidase (300 USP-Einheiten/mg; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) in Hepes-CZB dispergiert. Kumulusfreie Oozyten wurden in CZB bei 37,5°C unter 5% CO2 in Luft für weniger als 1 Stunde vor weiteren Behandlungen aufbewahrt.

Enukleation von Empfängerozyten

Die Enukleation reifer Oozyten wurde in Hepes-CZB mit 5 μg/ml Cytochalasin B durchgeführt. Die Oozyten wurden vor der Enukleation für etwa 10 Minuten (25°C) in diesem Medium gehalten. Eine mit einer Haltepipette gehaltene Oozyte wurde gedreht, bis ein kleiner, durchscheinender ooplasmatischer Fleck – der Ort der Metaphase-II-Chromosomen – zu erkennen war. Nachdem die Zona pellucida mit der Enukleationspipette (etwa 10 μm Innendurchmesser) durch Anwendung einiger Piezo-Impulse angebohrt worden war, wurde ihre Spitze bis zum durchscheinenden Fleck im Ooplasma vorgeschoben. Das durchscheinende Ooplasma (mit Metaphase-II-Chromosomen) wurde in die Pipette gesaugt, ohne die Plasmamembran zu durchbrechen, und vorsichtig von der Oozyte weggezogen, bis eine gestreckte Zytoplasma-Brücke abgekniffen wurde. Wie durch Fixierung und Färbung der Oozyten oder durch Hoechst 33342-Färbung festgestellt wurde, lag die Effizienz der Enukleation bei 100 %.

Identifizierung von „lebenden“ und „toten“ ersten Polkörpern

Oviduktale Oozyten wurden von B6D2F1-, CD1- und C3H-Weibchen zwischen 13 und 27 Stunden nach der hCG-Injektion gesammelt. Die Lebensfähigkeit der Polkörper wurde mit einem im Handel erhältlichen Testkit für die Zelllebensfähigkeit (Live/dead FertiLight; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) bewertet, das anhand des Fluoreszenzfärbemusters unter einem UV-Mikroskop zwischen Plasmamembran-intakten („lebenden“) und beschädigten („toten“) Zellen unterscheidet. Die Chromosomen in lebenden Polkörpern mit intakten Plasmamembranen fluoreszierten grün, während sie in toten Polkörpern hell orange-rot fluoreszierten. Die Ergebnisse unserer ersten Beobachtungen zeigten, dass alle lebenden Polkörper eine scharf abgegrenzte, glatte Membran und klares Zytoplasma aufwiesen (Abb. 1A). Ihre Chromosomen waren verstreut, gestreckt oder aneinander haftend. Einige tote Polkörper hatten eine glatte Plasmamembran, aber bei den meisten war die Membran rau oder fehlte. Das am leichtesten erkennbare Merkmal des toten Polkörpers war ein stark granuliertes Zytoplasma, unabhängig vom Zustand der Plasmamembranen und Chromosomen (Abb. 1B).

Transfer von Chromosomen des ersten Polkörpers in entkernte Eizellen und anschließende Injektion von Spermien

Die Technik für den Transfer und die Injektion war ähnlich wie bei der Injektion von Spermatidkernen in Eizellen. Eine Eizelle mit einem lebenden ersten Polkörper wurde ausgewählt und ihre Zona pellucida wurde mit einer piezobetriebenen Injektionspipette angebohrt. Die Plasmamembran des Polkörpers wurde durch Ansaugen in die Pipette aufgebrochen. Der gesamte Inhalt des aufgebrochenen Polkörpers wurde sofort in eine enukleierte Eizelle injiziert. In einer separaten Versuchsreihe wurde der gesamte Inhalt eines toten Polkörpers injiziert. Die mit dem Polkörper injizierten Oozyten wurden vor der zweiten Injektion eines Spermatozoon 2 Stunden lang bei 37,5 °C und 5 % CO2 in Luft in CZB inkubiert. Unmittelbar vor der Spermieninjektion wurden einzelne Spermatozoen durch Anlegen einiger Piezo-Impulse in der Halsregion geköpft. Ein einzelner Spermienkopf wurde in jede Oozyte injiziert, wie von Kuretake et al. beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Vorgang bei Raumtemperatur (23-25°C) statt bei 17-18°C durchgeführt wurde.

Oozytenuntersuchung und Embryotransfer

Einige Oozyten wurden zwischen 10 min und 2 h nach der Injektion untersucht, um festzustellen, wie sich die Polkörperchromosomen im Zytoplasma der Oozyte verhalten. Andere Eizellen wurden 5-6 Stunden später auf die Häufigkeit einer normalen Befruchtung untersucht. Eizellen mit einem zweiten Polkörper und zwei Vorkernen galten als normal befruchtet und wurden über Nacht in CZB kultiviert. Regelmäßige Embryonen im 2-Zell-Stadium wurden dann in die Eileiter von Empfängerinnen übertragen, die in der vorangegangenen Nacht mit vasektomierten Männchen gepaart worden waren.

In einer Reihe von Experimenten wurden C3H-Mäuse als Polkörper-Spender verwendet. Alle Empfängerozyten und -spermatozoen stammten von B6D2F1-Mäusen. C3H-Mäuse sind homolog in vier Haarfarbgenen, A (Agouti), B (braun), C (Albino) und D (verdünnt), d. h. A/A, B/B, C/C, D/D. B6D2F1-Mäuse sind A/A, B/B, C/C, D/D. Wenn die Enukleation der B6D2F1-Eizellen fehlgeschlagen wäre und sie von B6D2F1-Spermien befruchtet worden wären, wäre das Fell aller Nachkommen schwarz (a/a,B/+,C/C,D/+), braun (a/a,b/b,C/C,D/+) und grau (a/a,+/+,C/C,d/d), aber nicht agouti oder weiß gefärbt gewesen. Hätten nur C3H-Polkörperchromosomen und B6D2F1-Spermachromosomen an der Entwicklung der entkernten Eizellen teilgenommen, würde man erwarten, dass alle Nachkommen Agouti-Färbungen haben (A/a,B/+,C/C,D/+).

Am 19. Tag postcoitum wurden die Empfängerweibchen ohne offensichtliche Anzeichen einer Schwangerschaft getötet und ihre Gebärmutter auf das Vorhandensein von Föten untersucht. Ein Kaiserschnitt war notwendig, weil eine Empfängerin mit ≤ 2 Föten nicht in der Lage war, selbst zu gebären. Lebende Föten, sofern vorhanden, wurden von säugenden CD1 (Albino)-Pflegetieren aufgezogen. Andere Weibchen durften ihre Nachkommen zur Welt bringen und aufziehen.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt den Anteil der lebensfähigen ersten Polkörper zu verschiedenen Zeitpunkten nach der hCG-Injektion. Da die Ovulation bei der Maus zwischen 10 und 14 Stunden nach der hCG-Injektion stattfindet, scheinen die meisten ersten Polkörper vor oder kurz nach der Ovulation degeneriert zu sein. Dennoch waren 5-15% der Polkörper noch viele Stunden nach dem Eisprung lebensfähig.

Wenn ein lebender erster Polkörper in eine enukleierte Oozyte injiziert wurde, aggregierten die Polkörperchromosomen allmählich (Abb. 3, A und B). Bereits 2 Stunden nach der Injektion waren die Chromosomen auf der Metaphasenplatte der zweiten meiotischen Teilung angeordnet (Abb. 3C). Chromosomen in toten Polkörpern verwandelten sich nie in typische Metaphase-Chromosomen (Abb. 3D).

Wenn insgesamt 171 enukleierte Eizellen mit lebenden ersten Polkörpern injiziert wurden, überlebte etwa die Hälfte (Tabelle 1). Nach der Injektion eines einzelnen Spermiums (Abb. 4A) wurde die Mehrheit der Eizellen normal befruchtet (Abb. 4B), unabhängig vom postovulatorischen Alter der Polkörper (Tabelle 1). Die Übertragung von 74 zweizelligen Embryonen auf 11 Pflegemütter führte zur Geburt von 27 normalen Nachkommen (Tabelle 1). Davon wurden 3 durch Kaiserschnitt von zwei Weibchen geboren. Die anderen wurden auf natürlichem Wege geboren. Alle 27 Nachkommen wurden aufgezogen, und es wurde eine Verpaarung zwischen ihnen durchgeführt. Alle 15 Weibchen wurden trächtig und hatten Würfe von normaler Größe (8-12).

Diskussion

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Chromosomen innerhalb des ersten Polkörpers das gleiche genetische und reproduktive Potenzial haben wie die, die nach der ersten meiotischen Teilung in der Oozyte verbleiben. Die Chromosomen in den toten Polkörpern haben sich nach der Injektion in die Eizelle nicht organisiert. Die Chromosomen in den lebenden Polkörpern waren verstreut, gestreckt oder aggregiert. Wir wissen nicht, ob es einen kausalen Zusammenhang zwischen dem Zustand der Chromosomen im Polkörper und dem Erfolg/Misserfolg der Embryonalentwicklung nach der Injektion gibt.

Unter normalen Bedingungen degeneriert der erste Polkörper der Maus recht schnell. Nach Evsikov und Evsikov degeneriert mehr als die Hälfte innerhalb weniger Stunden nach dem Eisprung, und die überwiegende Mehrheit zerfällt innerhalb der nächsten 12 Stunden. Beim Menschen dagegen überdauern viele erste Polkörper mehr als 20 Stunden nach dem Eisprung. Im Allgemeinen hat der erste Polkörper bei eutherischen Säugetieren jedoch eine kürzere Lebensdauer als der zweite Polkörper. Obwohl die Degeneration von Polkörpern (und auch von unbefruchteten Eizellen) wahrscheinlich ein apoptotischer Prozess ist, sind die Faktoren, die die individuellen und artenspezifischen Unterschiede in den Degenerationsraten von Polkörpern (und unbefruchteten Eizellen) bestimmen, nicht bekannt.

Wie hier gezeigt wurde, sind lebende erste Polkörperchromosomen in der Lage, nach dem Transfer in reife Eizellen die zweite Meiose zu durchlaufen, unabhängig von ihrem postovulatorischen Alter. Beschädigte Polkörperchromosomen, wie von Rodman gezeigt, sind dazu offenbar nicht in der Lage. Daher können Chromosomen in lebenden Polkörpern, die zur Degeneration bestimmt sind, durch den Transfer in das Ooplasma gerettet werden.

Die Überlebensrate der Eizellen nach der Polkörperinjektion war nicht sehr hoch (siehe Tabelle 1), was vielleicht an der großen Größe der Injektionspipette lag. Die Überlebensrate der Eizellen kann wahrscheinlich durch technische Verbesserungen erhöht werden. Außerdem hat die Eizelle der Maus (mit einem Durchmesser von etwa 75 μm) einen relativ großen Polkörper (mit einem Durchmesser von etwa 10 μm). Der hier beschriebene mikrochirurgische Eingriff wird sich wahrscheinlich als einfacher erweisen, wenn die Polkörper im Verhältnis zur Größe der Eizelle kleiner sind, wie dies bei Tieren (z. B. Rindern) und beim Menschen der Fall ist.

Obwohl technisch schwieriger als Blastomer-Chromosomenanalysen aufgrund der geringeren Größe der Polkörper, wurden Polkörper-Chromosomenanalysen in großem Umfang bei der genetischen Präkonzeption beim Menschen eingesetzt. Da Polkörper leicht verfügbar sind, wäre die genetische Diagnose mit Polkörpern weiterhin wertvoll, wenn wir mögliche Fallstricke im Auge behalten. Bei Versuchstieren wäre die Gendiagnose mit Hilfe von Polkörpern beispielsweise bei der markergestützten Auswahl weiblicher Gameten und der Identifizierung transgener Eizellen nützlich.

Da es jetzt möglich ist, sowohl den ersten als auch den zweiten Polkörper für die Erzeugung fruchtbarer Nachkommen zu verwenden, kann die genetische Information in einer Eizelle auf vier Nachkommen übertragen werden (Abb. 5). Da die Spendereizellen vor dem Transfer der Polkörperchromosomen enukleiert werden, haben alle Nachkommen keinen anderen genetischen Einfluss von den Spendereizellen als von den mütterlichen (Eizellen-)Mitochondrien. Da jede Eizelle ein anderes Spermium erhält, stellt diese Art der Fortpflanzung kein Klonen dar. Vier Eizellen erhalten unterschiedliche mütterliche und väterliche Gene. In einer extremen Situation, in der es nur noch wenige Weibchen einer Art gibt, könnte die Verwendung von Polkörpern auf diese Weise dazu beitragen, die genetische Vielfalt der Nachkommen zu erhöhen, vorausgesetzt, dass Eizellen eng verwandter Arten leicht verfügbar sind.

Danksagungen

Besonderer Dank gilt Dr. J. Michael Bedford für die Durchsicht einer frühen Version des Manuskripts. Wir danken Frau Charlotte Oser für ihre Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.

Autorenhinweise