結果
基礎膜特性
本研究で述べた結果は、in vivo whole-cell recording techniqueによって測定したIO（主要オリーブ、副オリーブ、Kooy背部キャップ）の61ニューロンから得られたものであった。 生体内で測定された基本的な膜特性は、in vitroで測定されたものと同等であった (2, 16-18) 。 生体内で記録されたIOニューロンは、平均周波数0.87 ± 0.22 Hz、平均規則性0.74 ± 0.02 で活動電位を発火させた。 静止膜電位は-55.6 ± 0.7 mV、膜容量は184.0 ± 11.3 pF、入力抵抗は45.9 ± 4.2 MΩであった。 IOニューロンの電気生理学的挙動は、正と負の電流パルスの注入によってさらに研究された（図1 AとB）。 これまでのin vitro研究では、H電流の活性化の結果、しばしば強い「脱分極のたるみ」が見られたが（19, 20）、我々のin vivo研究では、ごく少数（18％；図1 A）にしか脱分極のたるみは見られなかった。 さらに、同じ負電流注入でも、大多数の症例（61%）で強いリバウンド分極が誘発された。 負電流の振幅を大きくすると、反発分極が大きくなり、やがて体性低閾値Ca2+スパイクが誘発され（図1A）、これが高速ナトリウムスパイクの引き金となった。 細胞内の脱分極電流パルスはほとんど活動電位やスパイク適応を起こさず、脱分極ステップに続いて超分極サグが発生したのは23%の細胞のみであった（図1 B）
生体内のIOニューロンの全細胞記録は、様々なパターンの静止膜電位活動を示した（図1のC）。 in vitroの研究では、閾値以下の正弦波状振動とリズミカルな低閾値Ca2+スパイクは事実上過分極したニューロンでのみ起こり、同じニューロンで同時に起こることはほとんどない（2、6）のに対し、我々のin vivo記録ではIOニューロンもこの2種類の振動を自発的に、比較的頻繁に一緒に示すことが明らかにされた。 私たちは、4種類の異なる閾値下活動のパターンを観察しました。 (i) 平均振幅5.6 ± 0.6 mVの典型的なリズミカルな4-8Hz正弦波閾値下振動（SSTO）（図1 C2）; (ii) 平均振幅4.2 ± 0.6mVのリズミカルな1-3Hz低閾値Ca2+振動（LTOs）; (i) 平均振幅5.6 ± 0.6 mVの正弦波-4-8Hz正弦波閾値下振動（SSTOs）;（図1 C1）.3 mV (Fig. 1 C3); (iii) 上記の両方の振動活動が複合したパターン (Fig. 1 C1); (iv) 静止膜電位に閾値以下の振動が存在しないパターン (Fig. 1 C4) であった。 最初の3つのパターンでは、振動の振幅は一定か、周期的に変化することがわかった。 第4のパターンでは、低閾値Ca2+電流が観測されず、高い発火周波数（最大30Hz）が脱分極によって誘発される亜集団（わずか3ニューロン）が存在した。
ニューロンの分類
閾下膜活動のパターンはIOニューロン間でかなり異なるようなので、上記の違いが統計的手段によって立証できるかどうかを検討した。 すなわち、SSTO と LTO の両方を示すニューロンが 16%（type I）、SSTO のみを示すニューロンが 13%（type II）、LTO のみを示すニューロンが 56%（type III）、そして 15%（type IV）は閾値下振動を示さないというものであった。 さらに、これらのクラスターの同一性は、LTOとSSTOの活性を頻度の高い順にプロットしたマトリックスで容易に確認することができた（図2 B）。 ニューロバイオチンを細胞内投与したタイプI、II、IIIのニューロンは、細胞生理学的な特徴は明らかであるものの、形態学的な区別がつかず（いずれもn = 4; SI Fig. タイプIVニューロンは出現頻度が低いためラベル化しなかったが、IOの内側で500〜750μmの深さで3個記録され、その活動はUrbanoら(21)が記載したニューロンの活動に酷似していた。 したがって、これらのニューロンは、おそらくKooyの背側キャップからのオリバリー・ニューロンである
膜電位の閾値下振動に基づくクラスター解析。 (A)階層的クラスター分析により、4つの特徴的なグループにクラスタリングされた：タイプIニューロン（青）はSSTOとLTOを示し、タイプIIニューロン（緑）は純粋なSSTOのみを示し、タイプIII（黒）ニューロンはLTOのみを示し、タイプIVニューロン（赤）は閾下活動なしを示す。 *は、Kooy背側被蓋に由来すると推定されるオリバリー・ニューロン（21）。 (B) 嗅球ニューロンの閾値下発振周波数のマトリックスプロット表示と、階層的クラスター分析による分類。 (C)ニューロビオチン標識神経細胞の再構成。 標識された細胞（3種類）はすべてIOに存在し、類似した形態を示した。 DAO, dorsal accessory olive; PO, principal olive; DM, dorsomedial group of PO; MAO, medial accessory olive; DMCC, dorsomedial cell column; VLO, ventrolateral outgrowth; β, beta cell group.
個々のオリバルニューロンの識別が固定されているかを調べるために、それらの閾下振動の時間的（平均23分間）安定性を調査した。 2分間の自発的な記録と、少なくとも5-10分後の同じエピソードの記録とを比較した。 2分間の時間枠内では、閾値下活動の遷移は観察されなかった（Fig. 3 A）。 しかし、61個のニューロンのうち4個（7％）は、最初のエピソードに対してその後のエピソードで変化を示した（図3 B）。 2つのタイプIの細胞がタイプIIIの細胞に、2つのタイプIIIの細胞がタイプIの細胞になったのである。 これらの4つの変化はすべてSSTO活性のシングルイベント遷移であり、LTOの有無がある細胞の決定的な特徴であるのに対し、SSTOのそれらはまれに現れたり消えたりすることがあることを示している。 さらに、ケタミン、キシラジンの代わりにミダゾラム、メデトミジン、フェンタニルの混合麻酔をかけた動物（n = 21、上記61の報告に加えて）で全細胞記録を行ったところ、同じ種類の振動が一貫して観察された。 さらに、ケタミン・キシラジン麻酔の深さが振動の特徴に影響を与えるという証拠は見つからなかった（n = 8; 上記報告された細胞の上に）（SI Fig.7B ）。 後者の記録では、脳波記録を用いて麻酔の状態と深さを決定し、Guedel（文献23；文献22も参照）によって記述された周波数帯に従って修飾し、少なくとも40分続いた記録中にGuedelのステージIII-2とIII-3を比較した（SI 表2）
オリーブ神経細胞における閾値下振動周波数の安定性。 (A)タイプI、タイプII、タイプIIIのニューロンから120秒間自発的に記録した時間閾値下振動周波数表示。 パワースペクトルの振幅は色分けされている。 (B) 嗅神経細胞は、5-10分離れた2つの異なる時間枠で得られた振動行動に対して行われた2つのクラスター分析に供された。 *7122>
ポストホック解析の結果、静止膜電位、膜容量、発火率、スパイク間隔の変動係数、リバウンド脱分極や過分極サグの発生などの特性はいずれも4種類の細胞で有意差はなかった（SI表3）。 一方、III型ニューロンではH電流による脱分極の発生が有意に少なく、その最短優先スパイク間隔（ISI）は有意に長く（すべてP値<0.02）、平均入力抵抗はIV型ニューロンで有意に高かった（I、II、III型ニューロンとの比較ではすべてのP値<0.03）（SI Table 3）。*1)
したがって、オリーブ神経細胞は、その閾値下振動の特定の周波数特性および特定の膜および応答特性を有する4つのタイプに分けることができ、いずれも時間的に比較的安定していると結論した。
好ましいスパイクパターン.
オリーブ神経細胞の発射挙動に対して閾値下振動が貢献しているかどうかを調べるために、そのスパイクパターンと閾値下活動とを関連させて分析した。 4つのタイプの発火頻度に有意な差はなかったが、優先的なスパイクのパターンが異なっていた（図4）。 タイプIはISIが139±8msで、120msから190msの範囲でSSTOのリズムと一致する優先的なスパイクパターンを示した（図4 A）。 さらに、タイプIの細胞は、LTOの存在に対応する454から802msの範囲の平均ISI、629±74msの第2の優先的スパイクパターンを有していた。 タイプIIニューロンは、ISIが78〜211msの範囲で優先的なスパイクパターンを示したが、これもSSTOの波長に対応していた（図4 B）。 タイプIIIのニューロンでは、460〜641msの長いISIを持つスパイクパターンのみが見つかり（図4 C）、これもLTOの存在と一致した。この好ましいスパイクパターンは、他のタイプのニューロンとは有意に異なった（SI Table 3; ANOVA: P < 0.01; post hoc least significant difference test: P < 0.01). 最後に、閾値以下の活動から予想されるように、タイプIVのニューロンは優先的なスパイクパターンを示さなかった（図4 D）。 好発スパイクの頻度と閾値下振動の頻度を細胞ごとに直接相関させると、相関が明らかになった（r 2 = 0.95）（図4 E）。
好みのスパイクパターンを示す自己相関図。 (A)複数の優先スパイクパターンを示すタイプIのニューロン。 (B)80-200msで優先的なスパイクパターンを示すタイプIIニューロン(緑色の枠で示す)。 (C) 600-800msに優先的なスパイクパターンを示すタイプIIIのニューロンの例（灰色のボックスで示す）。 (D)優先的なスパイクパターンを示さないタイプIVのニューロン。 (E) 嗅覚振動周波数と優先的スパイクパターン周波数の相関（線形フィット：y = 1.2x – 0.4; r 2 = 0.95）
応答特性。
体性感覚刺激によって活動電位と興奮性シナプス後電位（EPSP）が誘発されたのは、I、II、III型ニューロンの大半（85％）で、IV型ニューロンにはなかった（χ 2検定、P < 0.05；SI 表2）。 平均応答/刺激効率は23.6 ± 3.2% (n = 20)、平均応答待ち時間は47.2 ± 3.9 ms (n = 20)であった。 各細胞タイプは特徴的な反応パターンを持っていた。 タイプ I のニューロンでは、37.1 ± 7.1 ms の短潜時または 411 ± 113 ms の長潜時の刺激で EPSP と同様に活動電位を誘発した（短・長秒時反応の混合については、図 5 A を参照されたい）。 タイプIIニューロンでは、短潜時反応はタイプIニューロンと同等であったが、長潜時反応（172±23ms）は有意に短かった（P < 0.02）（図5 B）。 さらに、これらのニューロンでは、刺激は活動電位や閾値下電位を誘発するだけでなく、正弦波状の閾値下振動の位相もリセットした。これらのリセットは、活動電位を誘発する刺激後と閾値下電位のみを誘発する刺激後の両方に生じた（図5 B2およびB3）。 III型ニューロンでは短時間反応（51.2±5ms）、長時間反応（516±38ms）ともにI型、II型ニューロンより長かった（P < 0.02）（図5 C）。 さらに、刺激誘発応答に続く平均抑制期間（465±43ms）は、これらの細胞で有意に長かった（P < 0.02）。 一般に、これらの抑制期間の長さは、刺激が活動電位を誘発したときの方が、興奮性閾値下反応のみを誘発したときよりも長かった（図5 BとCを比較）。 これらの結果は、オリーブオイルの閾値下振動とスパイキングパターン（すなわちオリーブオイルの出力）に対する末梢入力の強い調節的影響を示している
末梢感覚刺激後の反応特性。 (A1）末梢刺激に反応したタイプIニューロンの150個のトレースと、その結果平均化されたトレースを下のトレースに示す。 (A2) A1の部分集団：活動電位で応答した同じニューロンの痕跡とその平均化された痕跡を下に示す。 (A3）A1の相補的な部分集団：スパイクで応答しなかったトレースとその平均化されたトレースを下に示す。 (BとC) Aと同じパネルであるが、タイプIIとタイプIIIの細胞についてである。 刺激が活動電位を引き起こす場合（A2、B2、C2参照）だけでなく、そうでない場合（A3、B3、C3）にも抑制期間を引き起こすことができることに注意。 B3では、末梢刺激によって活動電位のない振動する閾値下応答の位相をリセットすることもできることがわかる。 赤棒は周辺刺激の投与時間。
発振とスパイキングの相互作用。
以上のデータから、活動電位はその後の閾値下振動の位相を正確にリセットできることが示唆され、これはin vitroでも観察されている(24)。 この関係をさらに定量化するために、タイプIIニューロンにおける活動電位の前後での振動の位相を比較した(図6)。 タイプIIニューロンの閾値下振動の位相は、自発または刺激誘発活動電位の発生後にのみリセットされ、これらの活動電位が振動のピークに正確に発生しない場合にのみ、リセットされた。 活動電位後の振動の位相は一貫してリセットされ、新しい正弦波ピークは先行する活動電位の後、≈360°の周期で発生した（図6）。 この関係は、自発的活動電位と刺激誘発活動電位の両方に当てはまりますが、位相のずれは刺激誘発電位の後の方がやや大きいようです(Fig.6)。
位相応答曲線。 II型ニューロンの閾値下振動の位相は、自発（開丸）または刺激誘発（塗りつぶし丸）活動電位の発生後、これらの活動電位が振動のピークに正確に発生しない場合にリセットされた。 (挿入図）活動電位の発生前後における閾値下振動の位相値の比較例。 赤のトレースは、活動電位発生前のトレースを正弦波でフィットさせ、活動電位発生後に外挿したもの。 スパイク動作は後続の振動の位相に影響を与えるだけでなく、振動の位相も活動電位の発生確率に強い影響を与えた。 Fig. 6は、振動の谷間（180°と360°の間）では、スパイクしている細胞がほとんどないことを示している。 このように、オリーブ神経細胞のスパイク動作と閾値下振動動作は、生体内で強く相互作用していると結論付けることができる
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