Chemikálie a činidla
GT byl zakoupen na trhu v Taichungu na Taiwanu. IS (čistota 97 %) byl získán od společnosti Alfa Aesar (Lancaster, Spojené království). 6,7-dimethoxykumarin (6,7-DMC, čistota 98 %) byl dodán společností Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA). EC (čistota 90 %), ECG (čistota 98 %), EGCG (čistota 95 %), kyselina mravenčí, probenecid, kyselina fosforečná (ledová, 85 %) a methyl-paraben byly zakoupeny od společnosti Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). EGC (čistota 92,7 %) byl získán od společnosti ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.). a ethylacetát byly LC kvality a byly získány od ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Tchaj-wan). Acetonitril byl třídy LC/MS a byl zakoupen od společnosti Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA). Fetální hovězí sérum bylo získáno od společnosti Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Izrael). Penicilin-Streptomycin-Glutamin, Dulbecco‘ s Modified Eagle Medium, trypsin/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution Solution a 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid byly zakoupeny od společnosti Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 bylo získáno od společnosti Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA). 6-Karboxyfluorescein byl zakoupen od společnosti AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, USA) a 5-karboxyfluorescein byl získán od společnosti Acros Organics (Geel, Belgie). Pro všechny přípravy byla použita voda Milli-Q plus (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.).
Příprava a charakterizace infuze GT
Infuze byla vyrobena namáčením 2 nebo 4 g GT v 50 ml horké deionizované vody (98-100 °C) po dobu 30 minut. Infuze byla za horka filtrována gázou, aby se dosáhlo koncentrace 40, resp. 80 mg/ml, která byla čerstvě podána potkanům prostřednictvím žaludečního gávu.
Pro charakterizaci infuze GT bylo po filtraci infuze GT pomocí 0,2 μm filtru RC15 (Sartorious, Goettingen Německo) smícháno 100 μl filtrátu s 900 μl methanolu a odstředěno k odstranění precipitátu. Správně naředěný nálev (50 μl) byl spojen s 50 μl roztoku 6,7-DMC (2,0 μg/ml v methanolu) jako vnitřního standardu a 5 μl bylo podrobeno LC-MS/MS analýze. Systém HPLC zahrnoval čerpadlo Accela 1250 a automatický vzorkovač (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Chromatografické separace bylo dosaženo pomocí analytické kolony Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) s předfiltrem. Mobilní fáze se skládala z acetonitrilu obsahujícího 0,01 % kyseliny mravenčí (A) a vody obsahující 0,01 % kyseliny mravenčí (B) a byla naprogramována gradientovým způsobem takto: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) a 2/98 (12 min). Průtoková rychlost byla 0,2 ml/min. Výtok z kolony byl detekován sondou H-ESI (heated-electrospray ionization) -II s hmotnostním spektrometrem Quantum Access MAX triple stage quadrupole (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Jako plášťový plyn byl použit dusík o koncentraci 35 libovolných jednotek a pomocný plyn o koncentraci 10 libovolných jednotek. Srážková energie byla nastavena na -19/18 V, sprejové napětí na -3000/3000 V, teplota kapiláry na 350 °C, teplota odpařovače na 350 °C a offset čočky trubice na -80/88 V. Pro analýzu vybraných reakcí (SRM) byly použity následující hmotnostní přechody: EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) a 6,7-DMC (207/151). ESI-MS spektra byla zaznamenána v negativním iontovém režimu pro EC, EGC, ECG a EGCG a v pozitivním iontovém režimu pro 6,7-DMC.
Zvířata
Samci potkanů Sprague-Dawley (270-360 g) byli zakoupeni z National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) a byli umístěni v klimatizovaném prostředí s 12hodinovými cykly světlo/tma. Potravu a vodu dostávali ad libitum až 12 h před zahájením experimentů. Potkani byli rozděleni do dvou skupin. V prvním experimentu bylo použito 28 potkanů ke stanovení účinku GT na sérové hladiny IS a PCS u CRF potkanů; ve druhém experimentu bylo použito 14 potkanů k vyhodnocení účinku GT na funkci ledvin CRF potkanů. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v přísném souladu s doporučeními „Příručky pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání (2002)“ vydané Čínskou společností pro vědu o zvířatech na Tchaj-wanu. Protokol experimentu byl přezkoumán a schválen dne 1. 8. 2014 (číslo povolení: 103-126-N) Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Vytvoření modelu CRF a podání infuze GT
CRF byla vyvolána perorálním podáním adeninu podle předchozích studií, ale s určitou modifikací19,23,35,36 . Stručně řečeno, adenin suspendovaný v 0,5% methylcelulose 400 (15 mg/ml) byl perorálně podáván 28 potkanům prostřednictvím žaludeční kanyly dvakrát denně po dobu sedmi po sobě jdoucích dávek (15 mg/potkan) po celou dobu experimentu. Čtvrtý den byly stanoveny sérové hladiny IS. Po potvrzení oslabení funkce ledvin výrazným zvýšením sérových hladin IS byli CRF potkani rozděleni do tří skupin (8-10 potkanů v každé skupině) se srovnatelnými hladinami IS. První skupina dostávala 400 mg/5 ml/kg infuze GT dvakrát denně po sedm po sobě jdoucích dávek, druhá skupina dostávala 200 mg/5 ml/kg GT dvakrát denně po sedm po sobě jdoucích dávek a třetí skupina dostávala paralelně 5 ml/kg vody jako kontrolu. Osmý den byla potkanům podána sedmá dávka GT v 9:00 hodin ráno po nočním lačnění a vzorky krve byly odebrány v 0, 15, 30, 60, 120, 180 a 360 minutách po podání dávky. Plánovaný čas odběru krve a podání adeninu a GT je shrnut na obr. 3. V každém čase odběru bylo odebráno 0,5 ml krve v isofluranové anestezii. Vzorky krve byly odebrány do mikrozkumavek a centrifugovány při 10 000 g po dobu 15 minut pro získání séra, které bylo před analýzou uchováváno při -20 °C.
Stanovení koncentrací IS a PCS v séru
Pro stanovení koncentrací IS a PCS v séru bylo 50 μl vzorku séra smícháno s 200 μl metanolu obsahujícího 10 μg/ml 6,7-DMC, resp. 100 μg/ml methylparabenu jako vnitřních standardů a odstředěno k odstranění precipitátu, poté byl 20 μl alikvot podroben HPLC analýze.
Pro přípravu kalibrátoru bylo 50 μl séra obohaceno o sérii koncentrací IS a PCS, aby bylo dosaženo koncentračních rozsahů 0,4-25,0 μg/ml (1,8-117,3 μM), resp. 0,3-20,0 μg/ml (1,7-106,3 μM). Pozdější postup se řídil postupem popsaným výše pro vzorky séra. Kalibrační křivky byly sestaveny lineární regresí poměrů ploch píků (IS nebo PCS k vnitřnímu standardu) vůči známým koncentracím IS, respektive PCS.
Aparatura HPLC zahrnovala pumpu (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japonsko), fluorescenční detektor (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japonsko) a automatický injektor (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japonsko). Kolona Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) byla vybavena ochrannou kolonou (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokio, Japonsko). Mobilní fáze se skládala z acetonitrilu (A)-0,1 % kyseliny fosforečné (B) a byla naprogramována gradientovým způsobem takto: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) a 15/85 (24-35 min) pro IS a 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) a 16/84 (24-36 min) pro PCS. Nastavení detektoru bylo Ex 280 nm/Em 375 nm pro IS a Ex 214 nm/Em 306 nm pro PCS. Průtokové rychlosti byly 1,0 ml/min.
Vliv GT na Cr a BUN u potkanů s CRF
V dalším experimentu byl použit stejný protokol pro zvířata uvedený výše a koncentrace Cr a BUN byly stanoveny před léčbou adeninem (den 0), před podáním GT (den 4) a po 7. dávce GT (den 8). Po potvrzení oslabené funkce ledvin výrazným zvýšením Cr a BUN 4. den byli CRF potkani rozděleni do dvou skupin (7 potkanů v každé skupině) se srovnatelnými hladinami Cr. První skupina dostávala 400 mg/5 ml/kg GT dvakrát denně po dobu sedmi po sobě jdoucích dávek; druhá skupina dostávala paralelně 5 ml/kg vody jako kontrolu. Osmý den byla potkanům po nočním lačnění podána sedmá dávka GT a vody a o 30 minut později byly odebrány vzorky krve. Cr byl stanoven kinetickou alkalickou pikrátovou metodou v chemickém systému ADVIA 2400 (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). BUN byl stanoven pomocí reakce ureáza/glutamátdehydrogenáza ve spojení s enzymem na stejném analyzátoru.
Buněčné linie a kultivační podmínky
Konstrukce stabilně transfekovaných buněčných linií použitých pro transportní studie, buněk vaječníků čínského křečka (CHO) exprimujících hOAT1 (CHO-hOAT1), buněk lidských embryonálních ledvin 293 (HEK) exprimujících hOAT3 (HEK-hOAT3) a jim odpovídajících kontrolních buněčných linií transfekovaných prázdným vektorem, byla popsána již dříve40,41 . Buňky CHO byly udržovány při 37 °C s 5 % CO2 v médiu DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) obsahujícím 10 % séra, 1 % penicilinu/streptomycinu a 1 mg/ml G418. Buňky HEK byly udržovány při 37 °C s 5 % CO2 v médiu DMEM s vysokým obsahem glukózy (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) obsahující 10 % séra, 1 % penicilinu/streptomycinu a 50 μg/ml hygromycinu B. Buňky byly kultivovány v miskách potažených Poly-D-Lysinem.
Příprava a charakterizace sérových metabolitů GT (GTM)
Za účelem napodobení molekul interagujících s OAT in vivo byly připraveny a charakterizovány GTM z potkanů. Stručně řečeno, infuze GT (800 mg/10 ml/kg) byla perorálně podána potkanům nalačno přes noc. Krev byla odebrána 15 minut po podání infuze GT. Po srážení bylo odebráno sérum a promícháno s trojnásobným množstvím methanolu. Po centrifugaci při 10 000 g po dobu 15 min byl supernatant zahuštěn v rotační odparce ve vakuu do sucha. Ke zbytku byl přidán příslušný objem vody, čímž vznikl roztok o desetinásobné koncentraci séra, který byl rozdělen na alikvoty a uložen při -80 °C pro pozdější použití.
Podle předchozí metody s určitými úpravami16,46 byla charakterizována část GTM. Stručně řečeno, 100 μl vzorku séra bylo smícháno s 50 μl sulfatasy (obsahující 1000 jednotek/ml sulfatasy a 39 861 jednotek/ml ß-glukuronidasy), 50 μl kyseliny askorbové (200 mg/ml) a inkubováno při 37 °C po dobu 45 min v anaerobních podmínkách. Po hydrolýze bylo sérum přidáno do 50 μl 0,1 N HCl a poté rozděleno 250 μl ethylacetátu (obsahujícího 100 ng/ml 6,7-DMC jako vnitřní standard). Vrstva ethylacetátu byla odpařena pod N2 do sucha a před LC-MS/MS analýzou rekonstituována příslušným objemem mobilní fáze. Mobilní fáze se skládala z acetonitrilu (A) – vody obsahující 0,1 % kyseliny mravenčí (B) a byla naprogramována gradientovým způsobem takto: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) a 2/98 (12 min). Průtoková rychlost byla 0,2 ml/min.
Vliv GTM na transport zprostředkovaný hOAT1 a hOAT3
Buňky HEK-hOAT1 a HEK-hOAT3 (1 × 105 buněk/jamku) byly kultivovány v 96jamkové destičce. Jako sondy pro hodnocení účinku GTM na aktivitu hOAT1 a hOAT3 byly použity 6-karboxyfluorescein (6-CF) a 5-karboxyfluorescein (5-CF)47,48 . Kromě toho byl jako pozitivní kontrola pro inhibici hOAT1 a hOAT349 použit probenecid (80 μM). Po 24hodinové nebo 48hodinové inkubaci CHO-hOAT1 nebo HEK-hOAT3 bylo médium odstraněno a třikrát promyto pufrem PBS. Před transportním experimentem byly buňky CHO-hOAT1 a HEK-hOAT3 předem inkubovány s testovanými látkami (GTM a probenecid) při 37 °C. Po 30 minutách inkubace byl přidán 6-CF nebo 5-CF a inkubován dalších 5, resp. 10 minut. Destičky byly okamžitě umístěny do ledové lázně, supernatanty byly odstraněny a buňky byly třikrát promyty ledovým PBS. Následně bylo přidáno 100 μl 0,1% Tritonu X-100 k lyzi buněk a měřila se fluorescence s excitací při 485 nm a emisí při 528 nm. Pro kvantifikaci obsahu bílkovin v každé jamce bylo 10 μl buněčného lyzátu přidáno k 200 μl zředěného činidla pro stanovení bílkovin (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) a optická hustota byla změřena při 570 nm. Relativní intracelulární akumulace 6-CF nebo 5-CF byla vypočtena porovnáním s akumulací kontrol po korekci proteinu.
Analýza dat
Piková koncentrace v séru (Cmax) byla získána z experimentálního pozorování. Plocha pod křivkou sérová koncentrace – čas (AUC0-t) byla vypočtena pomocí lichoběžníkového pravidla do posledního bodu. Rozdíly IS a PCS mezi třemi skupinami byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVY, zatímco rozdíly Cr a BUN mezi dvěma skupinami byly analyzovány pomocí nepárového Studentova t-testu, přičemž za hladinu významnosti bylo považováno p < 0,05. Nepárový Studentův t-test byl použit také pro analýzu in vitro testů
.