Vzorky FFPE – příprava vzorků lidských tkání – Lab-Ally

Obsah

Úvod | Získávání tkání | Zpracování tkání FFPE | Sekce | Reference

Pokud potřebujete vzorky FFPE nebo jiné lidské biospeciální vzorky pro svůj výzkum, kontaktujte nás.

Úvod

Mnoho dnešních výzkumníků dává přednost použití vzorků tkání FFPE pro své IHC, histologické nebo in-situ genomické analýzy. Zkratka FFPE znamená „Formalin-Fixed Paraffin-Embedded“ a popisuje dvě klíčové vlastnosti této metody konzervace tkání. Formalin je roztok formaldehydu a používá se od konce 19. století, kdy německý lékař Ferdinand Blum objevil konzervační účinky formaldehydu (Fox a kol., 1985). Po fixaci formaldehydem se do tkáně vpraví parafín a tkáň se také obklopí parafínovým obalem, který ji pomáhá podepřít a chránit před oxidací. Profesionálně fixované a vložené vzorky FFPE a biomolekuly v nich obsažené jsou při okolní teplotě poměrně stabilní. Strukturálně jsou fixované a vložené tkáně odolné a lze je používat pro mikroskopické anatomické studie téměř neomezeně dlouho, ale časem dojde k degradaci antigenicity některých proteinů, což omezuje IHC studie na vzorky ne starší než několik desetiletí. Dvouvláknová DNA je v blocích FFPE překvapivě stabilní, ale jiné méně stabilní biomolekuly, jako je RNA, mohou degradovat během deseti nebo méně let, zejména po rozřezání řezů.

Archivy, které shromažďují velké množství vzorků FFPE, jsou obzvláště bohatým zdrojem dat, pokud je žádoucí porovnání mnoha případů (tj. vzorků FFPE od více dárců), aby bylo možné vyvodit statisticky spolehlivé závěry o charakteristikách konkrétních indikací. Pokud mají být vzorky FFPE použity v biomedicínském výzkumu s „vysokou sázkou“, je důležité, aby každou fázi procesu přípravy prováděli plně vyškolení a certifikovaní odborníci, nejlépe v laboratoři s certifikací CLIA (tj. kontrolované vládou) nebo akreditované CAP (College of American Pathologists).

Je třeba poznamenat, že proces FFPE není univerzálně standardizován a instituce po celém světě mohou používat mírně odlišné protokoly s různými roztoky formalínu nebo jinak přizpůsobovat proces svým preferencím a požadavkům. Následuje přehled procesu a popis toho, co jednotlivé kroky obnášejí, a také některé běžné varianty.

Získání tkáně

Před zpracováním tkáně je nezbytným krokem získání tkáně. Tento prvek je ve skutečnosti nejobtížněji kontrolovatelný, protože se prolíná s péčí o pacienty, dodržováním 41CFR46 a v USA s dohledem interní revizní komise (IRB). Specifika lékařského postupu a konvence standardní péče jsou důležité, protože mohou ovlivnit proměnné, jako jsou časové intervaly mezi podáním anestezie a podvázáním cév, odebráním tkáně a dobou uplynulou před fixací, z nichž každá může ovlivnit kvalitu vzorku. Například během časového intervalu, známého jako doba teplé ischemie, mezi podvázáním přívodu krve a odstraněním tkáně může dojít ke změnám v RNA a proteinech (Dash, et al., 2002). Tato doba ischemie se může pohybovat v rozmezí minut až hodin v závislosti na orgánu, standardních operačních postupech instituce, chirurgovi a dalším zúčastněném zdravotnickém personálu a chirurgickém přístupu. Z tohoto důvodu bylo doporučeno, aby tato doba byla u každého vzorku zaznamenána a aby byla omezena na minimum (Hewitt, et al., 2008).

Zpracování tkáněFFPE

Po získání vzorku tkáně může být zapotřebí další třídění, pitva nebo mikrodisekce (souhrnně označované jako grossing), aby se izolovala a připravila konkrétní část tkáně, která projde dalšími kroky zpracování. Zpracování tkání je dnes často zcela automatizováno až do posledního kroku, vložení, které může být provedeno ručně. K dispozici je mnoho tkáňových procesorů, ale všechny se řídí pořadím prvních čtyř výše uvedených kroků. Automatizace jednotlivých kroků pomáhá eliminovat odchylky v postupu jako zdroj rozdílů experimentálních výsledků mezi různými vzorky FFPE.

Fixace

Fixace je počátečním krokem při zpracování tkání FFPE. Mezi rozhodující faktory, které je třeba zvážit, patří použitý roztok, doba fixace a tloušťka a histologické vlastnosti fixovaného vzorku tkáně.

– Roztok

Fixační prostředek, který používá většina laboratoří, je neutrální pufrovaný 10% formalín. Formalin je kapalina, která obsahuje 37-40 % formaldehydu a 10 % metanolu (hmotnostních) ve vodě; 10% roztok formalinu tedy obsahuje přibližně 3,7-4 % formaldehydu a 1 % metanolu (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). Ve skutečnosti se formaldehyd vyskytuje v roztoku především jako monomery nebo malé polymery methylenglykolu (methanediol, monohydrát formaldehydu), který vzniká vratnou reakcí formaldehydu s vodou. Vysokohmotnostní polymery methylenglykolu se označují jako paraformaldehyd a vysrážejí se z roztoku, ale methanol tento proces polymerace zpomaluje, což je důvodem jeho zařazení do roztoků formalínu. Formalin zředěný vodou (např. 10% formalin) – a zejména pokud se jedná o pufrovací roztok – bude obsahovat hlavně monomery, protože obrovské množství molekul vody rozbije všechny polymery methylenglykolu, které by normálně existovaly v roztoku s vyšší koncentrací formaldehydu (Kiernan, 2000). Pufry, zbývající složka formalínu, se přidávají také proto, že formaldehyd má tendenci oxidovat na kyselinu mravenčí (Fox, et al., 1985). Kyselina mravenčí při fixaci tkání může vést k vysrážení formalínových pigmentových granulí (kyselý hematin), které mohou připomínat pigmenty produkované některými parazity (Pizzolato, 1976). Pufrování formalinu tomu zabraňuje. Mezi běžné pufry patří uhličitan hořečnatý, uhličitan vápenatý, citrát, tris a fosfátový pufr (Hewitt, et. al., 2008). Komerční formalín často obsahuje fosfátové pufry. „Neutrálně pufrovaný“, což je typický způsob přípravy formalínu, jednoduše znamená, že pH je udržováno na hodnotě přibližně 7.

– Proces a mechanismus

Vzhledem k nízké molekulové hmotnosti formaldehydu a metylenglykolu proniká formalín (především metylenglykol v roztoku) do tkání poměrně rychle, rychlostí, která závisí na typu tkáně, ale s průměrnou rychlostí 1 mm/hodinu (Hewitt, et al., 2008). Protokoly pro fixaci se tedy liší podle toho, jaký typ tkáně má být fixován. Po vstupu do tkáně se část molekul formaldehydu, které jsou přítomny v roztoku, začne síťovat s proteiny, ale děje se tak mnohem pomaleji než rychlostí difuze. Reakce formaldehydu s tkání jej vytahuje z roztoku a táhne tuto vratnou reakci formaldehydu na methylenglykol zpět směrem k formaldehydu, takže ho vzniká více, i když se spotřebovává (Fox, et al., 1985). Nejvíce reaktivní s formaldehydem jsou postranní aminořetězce lysinu, ale mezi další, které jsou do jisté míry reaktivní s formaldehydem, patří arginin, asparagin, histidin, glutamin, serin a tyrosin (Howat a Wilson, 2014). Po reakci může vzniklá hydroxymethylová skupina navázaná na komplex dále reagovat se stejným proteinem nebo jinými proteiny, a vytvářet tak stabilní methylenové můstky (protein-CH2-protein) (Kiernan, 2000). Právě to způsobuje nerozpustnost a tuhost tkání, které byly fixovány formalínem, a tím konzervovány. K tomu, aby toto zesíťování dostatečně proběhlo v celé tkáni, je zapotřebí přibližně 24-48 hodin (Thavarajah, et al., 2012), ale doporučuje se, aby tento proces netrval déle než 36 hodin, protože delší fixace snižuje kvalitu biomolekul ve vzorcích FFPE, například zkracuje délku nukleových kyselin, které lze extrahovat (Hewitt, et al..), 2008).

– Omezení

Hlavní výhodou použití formaldehydu – zejména ve formě neutrálně pufrovaného 10% formalinu – je, že uchovává širokou škálu tkání a složek. Má však svá omezení. Například pro elektronovou mikroskopii se obvykle používá kombinace formaldehydu s glutaraldehydem (C5H8O2) nebo roztok samotného glutaraldehydu (Kiernan, 2000), protože tyto roztoky lépe konzervují tkáňové struktury pro tento účel. Všimněte si, že tkáně připravené pomocí roztoku glutaraldehydu nebo glutaraldehydu a aldehydu nebudou považovány za vzorky FFPE. Dalším problémem je získání molekul DNA a RNA z tkáně FFPE, protože formalín má tendenci modifikovat nukleové kyseliny – dokonce až do té míry, že vnáší do DNA umělé mutace – a rozbíjí je na malé fragmenty (Srinivasan, Sedmak a Jewell, 2002). Přesto je možné z tkáně FFPE extrahovat fragmenty DNA a RNA, které jsou vhodné pro analýzu, jak je popsáno v protokolu, jehož autory jsou Tang a další (2009), přičemž klíčovým faktorem pro obnovu nukleových kyselin je vhodné štěpení proteázami. K dispozici jsou i komerční soupravy pro extrakci nukleových kyselin ze vzorků FFPE.

– Tloušťka vzorku

Jedním z dalších důležitých bodů, které je třeba zvážit v souvislosti s fixací ve formalínu, je tloušťka vzorku tkáně. Ačkoli formalín proniká do tkáně relativně rychle, jak bylo uvedeno výše, tloušťka tkáně ovlivní kvalitu fixovaného vzorku. K tomu, aby se formalín dostal do středu silnějších vzorků tkáně, bude zapotřebí více času. Zatímco formalín postupně difunduje do nejvnitřnějších částí vzorku, ve vnějších oblastech již bude proces fixace zahájen, takže biomolekuly tam budou s větší pravděpodobností degradovat za delší dobu potřebnou k celkové fixaci. Navíc, pokud jsou dodrženy časové limity (např. maximálně 36 hodin, jak je uvedeno výše), existuje možnost, že vzorek tkáně nebude dostatečně fixován (zachován) v celém rozsahu. Z tohoto důvodu by bylo lepší tkáně určené k fixaci, které jsou širší než několik milimetrů nebo třeba jeden či dva centimetry, rozřezat na tenčí segmenty pro optimální fixaci (Hewitt, et al., 2008). Instituce mohou mít různé protokoly pro délku času a objem fixativa potřebného pro vzorky tkání různé šířky, ale obecně by poměr objemu fixativa k objemu tkáně měl být 10:1 (Klatt, 2016).

Dehydratace

Druhým krokem při zpracování vzorků FFPE je dehydratace. Protože parafín je nemísitelný s vodou, musí být z tkáně odstraněna veškerá voda z roztoku formalínu, než do ní může parafín proniknout. K odstranění v podstatě veškeré vody z tkáně se použije řada roztoků alkoholu (často ethanolu), často se začíná 70% a postupuje se ke 100% alkoholu. Pro optimální odvodnění je nutné používat čerstvé roztoky nebo často měnit použité roztoky, protože alkohol se používáním stále více ředí. Je také nezbytné, aby byl tento krok dokončen v plném rozsahu (s dostatečnou časovou rezervou pro tento krok), protože nedostatečná dehydratace může vést k degradaci tkáně (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Odstranění

Protože parafín ve skutečnosti není mísitelný ani s alkoholy, dalším krokem je odstranění alkoholu pomocí látky, která je s parafínem mísitelná. Tento krok se nazývá clearing a nejčastěji používaným clearingovým činidlem je xylen (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Parafinová infiltrace

Po odpovídající fixaci, dehydrataci a clearingu lze nakonec tkáň podrobit parafinové infiltraci (nebo impregnaci). Ani tento krok není standardizován a instituce z celého světa mohou používat různé parafíny a směsi vosků různého složení. Parafíny mají různé body tání a textury, které ovlivňují výsledný tkáňový blok a jeho vlastnosti. Ve Spojených státech i v západní Evropě se pro dosažení nejlepších výsledků obvykle používají syntetické parafíny s nízkými body tání (55 °C-63 °C). Latex, dimethylsulfoxid a patentované „změkčovadla“ mohou být zahrnuty do receptury za účelem úpravy textury a poddajnosti konečného vzorku tkáně (Hewitt, et al., 2008).

Národnosti z jiných částí světa často zahrnují do svých receptur včelí vosk za účelem zlepšení poddajnosti a snížení teploty tání používaných parafínů nízké kvality. Včelí vosk však obsahuje kontaminující látky, jako je pyl, a snižuje kvalitu konečného vzorku. Vyšším teplotám tání je třeba se vyhnout, protože později vedou ke snížené a nedostatečné deparafinizaci vzorku tkáně a také ke snížení množství nukleových kyselin získaných z tkáně (Hewitt, et al., 2008).

Vkládání do parafínu

Posledním krokem při zpracování vzorků FFPE je vkládání do parafínu. Vzorek tkáně napuštěný parafínem je obklopen vrstvou parafínu. Je třeba dbát na správnou orientaci tkáňového bloku ve formě („kazetě“), protože to ovlivňuje rovinu řezu při krájení tenkých řezů z bloku mikrotomem (Klatt, 2016). Po ztuhnutí parafínového pouzdra je blok FFPE připraven ke skladování a zůstane dobře uchován po několik let, dokonce až desetiletí (Hewitt, et al., 2008).

Rozřezání

Jakmile je tkáň zalitá, je připravena k řezání na mikrotomu. Vzhledem k tomu, že tkáň není vždy zcela rovná proti přední straně parafínu, musí histotechnolog obvykle „čelit“ do bloku. Blok tkáně se vloží do držáku bloku mikrotomu a histotechnolog při nastavování úhlu držáku bloku tak, aby došlo k co nejmenší ztrátě tkáně, otáčí ručním kolečkem a pohybuje blokem nahoru a dolů proti ostrému noži. Blok se řeže tak dlouho, dokud se na čele bloku neobjeví celý reprezentativní úsek tkáně. Jakmile je tkáň přední, blok se položí na led, aby se ochladil, což usnadní řezání tenkých řezů; příliš teplý parafín vytvoří stlačenou tkáň se zvrásněnými řezy. Když je blok vychladlý, vloží se zpět do držáku bloku. Technik opět otáčí ručním kolečkem, tentokrát pomalým, rovnoměrným tempem, aby se vytvořily po sobě jdoucí tenké řezy, které k sobě přilnou a vytvoří tzv. stuhu.“ Páska se položí na teplou vodní lázeň (teplota se udržuje těsně pod bodem tání parafínu), aby se vyhladily všechny vzniklé vrásky. Poté technik vloží do vodní lázně mikroskopické sklíčko a „nabere“ vybraný(é) řez(y) tak, aby přilnuly ke sklíčku.

Nejběžnější tloušťka tkáňových řezů se pohybuje mezi 3-5 mikrometry (zkráceně mikrony), což je tloušťka jedné buňky. Sklíčka s 3-5mikronovými řezy se obvykle používají k barvení, ať už jde o standardní barvení hematoxylinem &eosinem (H&E), speciální barvení nebo imunohistochemické barvení (IHC). Výzkumní pracovníci často požadují místo tenkých řezů na preparátech „kudrlinky“. Curls jsou silnější řezy (10 mikronů a více), které se vkládají do zkumavek Eppendorf a obvykle se používají vždy, když je třeba ze vzorků FFPE extrahovat RNA nebo DNA. Tlusté řezy lze také vložit na sklíčka místo do zkumavek; to je optimální, pokud se k extrakci použije pouze část tkáně. V tomto případě se tkáň seškrábne ze sklíčka a vloží do zkumavky. Vzorky FFPE, které byly rozřezány, jsou strukturálně stabilní, a pokud jsou správně ošetřeny a skladovány, mohou být po určitou dobu po rozřezání použity k mikroskopické analýze, ale pokud mají být provedeny chemické extrakce, pak by obecně měly být řezy použity co nejdříve po rozřezání, aby se zabránilo oxidační a biologické degradaci exponovaných cílových molekul.

Hledáte informace o histologii a získávání bloků FFPE představujících konkrétní indikace? Podívejte se na naši stránku se zdroji o histologii. Společnost Lab-Ally je lídrem v oboru dodržování předpisů 45CFR46 a 21CFR11, eticky získávaných lidských biospecifik, bioinformatiky, správy vědeckých dat a dalších.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehydová fixace. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Changes in Differential Gene Expression because of Warm Ischemia Time of Radical Prostatectomy Specimens [Změny v diferenciální expresi genů v důsledku doby teplé ischemie vzorků po radikální prostatektomii]. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Manipulace s tkáněmi a příprava vzorků v chirurgické patologii: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue (Otázky týkající se získávání nukleových kyselin z tkání fixovaných formalínem a zalitých parafínem). Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehyd, formalín, paraformaldehyd a glutaraldehyd: Co jsou a co dělají. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Získáno z http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Formalinový pigment (kyselý hematin) a příbuzné pigmenty. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Fixace tkání a vliv molekulárních fixativ na navazující barvicí postupy. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Chemické a fyzikální základy rutinní fixace formaldehydem. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids [Vliv fixativ a zpracování tkání na obsah a integritu nukleových kyselin]. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). Extrakce DNA z tkání fixovaných formalínem a zalitých parafínem. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechnika: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Získáno z http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Přístup 28. prosince 2016

.