3.1 OMV: Složení, biogeneze a funkční role
OMV jsou odolné a diskrétní sférické lipidové dvouvrstvé nanostruktury o průměru 10 až 300 nm, které pocházejí z buněčného obalu a nejsou schopny samostatné replikace (Kulp a Kuehn, 2010; Huang a kol., 2016) (obr. 4). Odtržení OMV bylo poprvé pozorováno před více než 50 lety na transmisních elektronových mikrofotografiích zobrazujících ultrastrukturu bakteriální buněčné stěny (Bladen a Waters, 1963; Bayer a Anderson, 1965; Chatterjee a Das, 1967). Bylo zjištěno, že tyto nanosférické struktury se skládají z jediné membrány obklopující elektronově husté centrum (Work a kol., 1966). Další studie ze stejného období rovněž uváděly přítomnost „extracelulárních globulí“ v bezbuněčném supernatantu E. coli kultivované za podmínek růstu omezujícího živiny (Bishop a Work, 1965; Knox a kol., 1966; Work a kol., 1966). Proto se původně předpokládalo, že k tvorbě OMV dochází výhradně za stresových podmínek. Nicméně další výzkumy jasně prokázaly, že OMV lze detekovat i za nestresových podmínek, a to jak v laboratorních, tak v environmentálních podmínkách (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). V současné době je známo, že OMV přispívají k nesčetným klíčovým biologickým funkcím, a jednou z vůbec prvních popsaných rolí OMV je jejich zapojení do patogeneze, zejména jako nosičů faktorů virulence (přehled v Ellis a Kuehn, 2010). V průběhu let byly OMV přisuzovány další funkce v závislosti na druhu a kultivačních podmínkách, včetně vnitrodruhové/mezidruhové komunikace, reakce na obálkové stresy, získávání živin, horizontálního přenosu genů, působení jako „decoy“ agens i jako veřejné statky (podrobný popis viz Kulp a Kuehn, 2010 a Schwechheimer a Kuehn, 2015). Obecně se zdá, že OMV podporují přežití bakterie ve specifické environmentální nice, což podtrhuje jejich význam pro bakteriální homeostázu.
Obr. 4. Bakteriální homeostáza. Vnější membránové vezikuly gramnegativních bakterií. (A) Zobrazení vezikulu vnější membrány (OMV-horní panel) odvozeného od bakteriálního buněčného obalu (dolní panel). Zobrazeny jsou detaily vnější membrány (OM) a vnitřní membrány (IM), včetně transmembránových proteinů. V periplazmatickém prostoru, v němž se nachází vrstva peptidoglykanu (PG), jsou zobrazeny rozpustné periplazmatické proteiny, chybně složené proteiny a nukleové kyseliny. Obsah OMV znázorňuje část biomolekul, které byly identifikovány jak na jejich membráně, tak v lumen. (B a C) Transmisní elektronové mikrofotografie uranylacetátem negativně obarvené buňky Synechocystis sp. PCC 6803 uvolňující OMV (B, zvětšení 120 000×) a bezbuněčného koncentrovaného extracelulárního média Synechocystis sp. PCC 6803 ukazující několik OMV (C, zvětšení 40 000×).
(A)Založeno na Jan, A.T., 2017. Vnější membránové vezikuly (OMV) gramnegativních bakterií: aktualizace perspektivy. Front. Microbiol. 8, 1053.
Mnoho studií ukázalo, že OMV jsou obohaceny o složky OM, konkrétně LPS a OMP, a také o periplazmatické proteiny, fragmenty PG, a dokonce o cytoplazmatické a nukleové kyseliny (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). První zprávy ve skutečnosti nerozlišovaly MV uměle vytvořené v roztoku (kvůli přirozenému chování lipidů, které se přeskupují do vezikul a nevybíravě zachycují materiál z bakteriální lýzy) od intaktních OMV. V nedávné době umožnily zdokonalené izolační metodiky a nejmodernější omické techniky pečlivou analýzu složení OMVs. Pozoruhodné je, že OMV jsou ve skutečnosti obohaceny o specifické buněčné složky, zatímco o jiné jsou ochuzeny (Lee et al., 2008), což podporuje myšlenku, že výběr obsahu nákladu není náhodný proces. Například obsah OMV Salmonella sp. se lišil v závislosti na testovaných růstových podmínkách: v OMV izolovaných z buněk za podmínek s dostatkem živin byly přednostně detekovány cytosolické proteiny zapojené do translace a buněčného metabolismu, zatímco za limitujících nutričních podmínek byly OMV obohaceny o membránové proteiny zapojené do transportu živin (Bai et al., 2014). Přístup založený na hmotnostní spektrometrii navíc ukázal, že v OMV nebyla zjištěna žádná široce konzervovaná specifická složka (Schwechheimer et al., 2013), což opět ukazuje na variabilní složení. Celkově se předpokládá, že rozdílné složení OMVs souvisí jak se zvláštnostmi buněčných obalů závislými na kmeni, tak s odlišnými ekologickými nikami (Yoon, 2016).
Byly navrženy tři vzájemně se nevylučující mechanismy tvorby OMVs. V jednom modelu dochází k vezikulaci, když jsou kovalentní příčné vazby mezi membránovými proteiny a vrstvou PG lokálně porušeny, a to buď dočasným snížením celkového množství příčných vazeb, nebo lokalizovaným posunem příčných vazeb, což podporuje vyboulení malých částí OM. Jiný model zahrnuje periplazmatické nanoteritorie, v nichž se hromadí nesprávně složené proteiny a další složky obalu (LPS nebo fragmenty PG). Po tomto abnormálním, omezeném nahromadění buněčných složek se lokálně sníží integrita obalu, což vyvolá vyklenutí částí OM naplněných lumenálním obsahem. Nakonec bylo také navrženo, že zvláštní biofyzikální vlastnosti některých lipidů OM mohou podporovat vezikulaci tím, že přesně určují specifickou integraci LPS nebo fosfolipidů, což vede ke změnám ve fluiditě a flexibilitě membrány. Předpokládá se také, že velikost, rychlost produkce a složení OMV ovlivňuje mnoho dalších faktorů, a pokud existuje konsenzuální proces biogeneze OMV, není zcela charakterizován (Kulp a Kuehn, 2010; Schwechheimer a Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
Ve výzkumu sinic je oblast OMV stále poměrně nová a mnoho zbývá prozkoumat. Dobře to ilustruje zejména skutečnost, že nejstarší publikace věnovaná výhradně studiu sinicových OMV pochází z roku 2014 (Biller et al., 2014). V této průlomové studii se nejen ukazuje, že laboratorně kontrolované kultury mořské sinice Prochlorococcus kontinuálně uvolňují OMV, ale také že tyto vezikuly lze hojně nalézt ve vzorcích mořské vody. Kromě toho bylo prokázáno, že OMV Prochlorococcus jsou schopny podporovat růst heterotrofních bakteriálních kultur, čímž se tyto struktury podílejí na toku uhlíku v moři. Dále byly pozorovány interakce mezi mořskými fágy a vezikulami, což ukazuje na potenciál OMV působit jako „návnada“. Celkově autoři ilustrovali některé ze základních rolí OMV a jejich nesčetné důsledky pro mikrobiální ekosystémy (Biller et al., 2014). V novější publikaci byly OMV Prochlorococcus porovnány s OMV tří dalších mořských heterotrofů ve snaze odhalit četnost balení DNA do vezikul a rozdíly mezi jednotlivými taxony (Biller et al., 2017). Zkoumáním množství a distribuce DNA spojené s OMV se ukázalo, že DNA je různě zapouzdřena v rámci populací OMV a mezi nimi. Rozhodněji tato práce naznačuje, že mechanismus, který balí DNA do OMV, nefunguje u všech bakterií stejně (Biller et al., 2017). Kromě Prochlorococcus a mořských kmenů Synechococcus bylo prokázáno, že OMV tvoří a uvolňují i další sinice, včetně jednobuněčných Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) a Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), vláknité Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al., 2017) a vláknité, heterocysty tvořící Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) a Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Kromě výše popsaných rolí OMV odvozených od mořských sinic (Biller et al., 2014) byly navrženy i další funkce těchto extracelulárních vezikul. Uvolňování OMV sinicemi by mohlo fungovat jako účinná cesta sekrece. Ukázalo se, že metabolicky upravený kmen Synechococcus sp. PCC 7002 postrádající dva geny glykogen syntázy, glgA-I a glgA-II, uvolňuje výrazně více OMV než kmen divokého typu (Xu et al., 2013). Autoři předpokládali, že vzhledem k tomu, že u tohoto mutanta byl pozorován spontánní export rozpustných cukrů do média, mohly by pozorované OMV souviset s tímto mechanismem sekrece, i když obsah cukrů v pozorovaných OMV nebyl hodnocen (Xu et al., 2013). Kromě toho bylo také prokázáno, že kmen Synechocystis sp. PCC 6803 postrádající homolog TolC (nezbytný pro mechanismy sekrece závislé na membráně; viz obr. 1 a 3) uvolňuje výrazně více OMV než rodičovský kmen (Oliveira et al., 2016). Vzhledem k tomu, že tolC-knockout byl silně oslaben v sekreci intracelulárních proteinů, metabolitů a exogenních sloučenin, bylo navrženo, že potřebu sekrece by mohla naplnit hypervesikulace. Ve shodě s tím se také předpokládá, že sinice OMV transportují materiál potřebný pro vývoj biofilmu. To bylo navrženo na základě pozorování vezikul odvozených od sinic ve sporokarpu vodní kapradiny Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Navíc, protože uvnitř těchto vezikul byl údajně pozorován genetický materiál, mohly by být vektory pro laterální přenos genů mezi sinicí a kapradinou (Zheng et al., 2009). OMV sinic však mohou fungovat také jako mechanismus pro rozptýlení stresu obalu: Gonçalves a kol. charakterizovali soubor kmenů Synechocystis sp. PCC 6803, kterým chybí několik komponent IM translokázy zapojených do systémů sekrece závislých na TolC (Gonçalves a kol., 2018). Je zajímavé, že mezi různými kmeny vykazujícími různé schopnosti uvolňování OMV byl tolC-knockout (nejvyšší producent OMV ve studii) jediný, který vykazoval pozoruhodně vysoké hladiny transkriptů spy a degQ, kódujících proteiny zapojené do reakcí na stres obalu, a nadměrnou expresi Spy a DegP (Gonçalves et al., 2018). Autoři tak naznačili, že delece tolC vyvolává stres obalu a že hypervesikulace u tolC-knockoutu představuje nezávislý mechanismus, jak se s takovými stresovými podmínkami vypořádat (Gonçalves et al., 2018).