The function of chaperone proteins in the assemblage of protein complexes involved in gamete adhesion and fusion processes

Multiproteinové komplexy v kapacitaci spermií a interakci ZP

Po dosažení místa oplození, ampuly, musí spermie před splynutím s plazmatickou membránou oocytu neboli oolemmy proniknout dvěma bariérami. První z nich je vrstva kumulárních buněk bohatá na kyselinu hyaluronovou, která obklopuje oocyt, a druhou je extracelulární matrix samotného oocytu, ZP (Hartmann et al. 1972). Navzdory vývoji vazebných míst pro ZP i kyselinu hyaluronovou během spermatogeneze a získání vazebného potenciálu při průchodu spermií nadvarletem vyžadují tyto buňky odlišné období pobytu v samičím reprodukčním traktu, než jsou schopny se těchto interakcí úspěšně účastnit (Austin 1951, Chang 1951). Kolektivní změny, kterými spermie v tomto prostředí procházejí, označované jako kapacitace, umožňují buňkám reagovat na signály přicházející z komplexu kumulus oocytů a dokončit proces akrozomální exocytózy, čímž se stávají způsobilými ke splynutí s oolemou.

ZP se skládá ze sady sulfoglykoproteinů, konkrétně ZP1, ZP2 a ZP3, které jsou vysoce konzervované u většiny savčích druhů (i když u lidských a prasečích oocytů byl zaznamenán další ligand, ZP4/B) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Obecně se má za to, že tyto ligandy řídí vazbu spermií u většiny druhů (viz také Reid et al. (2011)). Pozoruhodné však je, že v současné době se stále zvažují různé modely týkající se identity primárního receptoru pro spermie v ZP a mechanismů, kterými spermie k této matrici přilnou (viz také Visconti & Florman (2010)). Podobně ani zkoumání identity příslušných povrchových receptorů spermií, které rozpoznávají příslušné ligandy na ZP, nepřineslo definitivní odpovědi. V literatuře totiž přibývá případů myších knokautů vhodných kandidátů na receptorové proteiny (včetně β-1,4-galaktozyltransferázy (GALT1), arylsulfatázy A (ARSA) a adhezivní molekuly 1 spermie (SPAM1); úplný seznam viz Ikawa et al. (2010)), z nichž každý nevedl k úplné neplodnosti (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Spíše se projevují různé stupně snížené vazebné schopnosti, což zvyšuje možnost, že tento proces zahrnuje určitý stupeň funkční redundance a že řada proteinů spermií působí ve shodě při zprostředkování adheze ZP. Koordinace aktivity těchto proteinů k zajištění produktivních interakcí se ZP se tak stává důležitým předmětem výzkumu.

U většiny eutheriánských savců se předpokládá, že kapacitace spermií je zahájena aktivací dráhy zprostředkované cAMP, která vrcholí tyrozinovou fosforylací několika proteinů spermií (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Mezi těmito proteiny zaujímají významné místo molekulární chaperony, přičemž HSP90AA1, HSP90B1 a HSPD1 patří mezi proteiny, u nichž byla zjištěna tyrozinová fosforylace jako důsledek kapacitace (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). Současné modely naznačují, že fosforylace těchto chaperonů během kapacitace spouští jejich aktivní roli při sestavování ZP rozpoznávacích proteinů do komplexů a/nebo translokaci těchto komplexů na povrch spermií při přípravě na oplodnění (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Kromě této nepřímé role v adhezi gamet mají povrchové chaperony spermií údajně také funkci adhezivních molekul, které zprostředkovávají rozpoznání sulfoglykolipidů během vazby gamet (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Nedávno byla technika modré nativní PAGE (BN-PAGE), která byla původně vyvinuta pro analýzu multienzymových komplexů elektronového transportního řetězce (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), upravena pro hodnocení multimerních komplexů na povrchu spermií u myší a lidí (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Tato technika umožňuje elektroforetické rozlišení nativních proteinových komplexů, které si zachovávají svou biologickou aktivitu. U lidských a myších spermií odhalilo použití BN-PAGE souběžně s Far-Western blottingem s celými solubilními zónami několik primárních multiproteinových komplexů, které mají afinitu k homologním ZP (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Jeden z takových komplexů se údajně skládá z proteinových složek komplexu CCT/TRiC (CCT1-CCT8), což je dvoukruhová struktura, která funguje jako molekulární chaperon s klíčovou úlohou při regulaci tvorby multiproteinových komplexů (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Předpokládané důkazy v podobě koimunoprecipitačních, kolokačních a proximity ligation testů identifikovaly ZP binding protein 2 (ZPBP2) jako jeden z nejpřesvědčivějších klientských proteinů pro komplex CCT/TRiC ve zralých spermiích (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Původně se podílel na sekundární vazbě ZP, novější studie ukázala, že myší samci nuloví pro ZPBP2 jsou subfertilní a vykazují defekty v interakci a penetraci ZP (Lin et al. 2007). U myší existují další důkazy, že některé podjednotky komplexu CCT/TRiC jsou během kapacitace spermií translokovány na jejich povrch (Dun et al. 2011).

Další významnou třídou chaperonů, která byla identifikována na povrchu spermií a zapojena do regulace interakcí ZP, je rodina HSP70 (Naaby-Hansen et al. 2010). Stejně jako u komplexu CCT/TRiC mají chaperony rodiny HSP70 také dobře zdokumentovanou roli v usnadňování transportu transmembránových proteinů i sestavování stabilních proteinových komplexů (Mayer & Bukau 2005). Zdá se, že jeden člen rodiny HSP70, který vykazuje výlučnou (myš) nebo převažující (člověk) expresi ve varlatech, je nezbytný pro mužskou plodnost. Aberantní exprese tohoto chaperonu, HSPA2, totiž koreluje s fenotypem těžké neplodnosti mužského faktoru u lidí, konkrétně ovlivňuje schopnost spermií interagovat s homologními oocyty in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). U myší i lidí hraje HSPA2 zásadní roli ve spermatogenezi, přičemž cílená delece proteinu u prvního druhu vede k časnému zastavení tohoto procesu a současně k absenci spermií (Eddy 1999). U lidí byly hladiny exprese HSPA2 pozitivně korelovány s úspěšností oplodnění in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003), a proto jsou údajně schopny s vysokou přesností předpovídat stav plodnosti mužů (Ergur et al. 2002).

Charakterizace HSPA2 v naší vlastní laboratoři odhalila, že tento chaperon je přítomen v akrozomální doméně lidských spermií a je součástí nejméně pěti vysokomolekulárních proteinových komplexů (Redgrove et al. 2012), včetně podskupiny těch, u nichž byla již dříve prokázána afinita k ZP (Redgrove et al. 2011). V souladu s těmito údaji jsme zajistili důkaz, že nejdominantnější z komplexů HSPA2 obsahuje dva další proteiny, z nichž oba byly dříve zapojeny do interakcí mezi spermií a zónou (Redgrove et al. 2012). Dále se nám ve shodě s publikovanými výsledky Huszara et al. podařilo prokázat významné snížení hladin HSPA2 ve spermiích mužů s izolovanými lézemi v jejich schopnosti zapojit se do interakcí se ZP homologních oocytů in vitro (Redgrove et al. 2012). Naše současná práce se zaměřuje na to, zda deficit v adhezi k ZP vyplývá buď z aberantní tvorby vazebných míst pro ZP v raných fázích spermiogeneze (Huszar et al. 2000), nebo může být důsledkem neschopnosti HSPA2 podílet se na událostech remodelace povrchu spermií během kapacitace, jako je usnadnění sestavení a/nebo prezentace receptorů ZP na povrchu spermie v rámci přípravy na interakci se ZP.

Kromě naší vlastní práce o sestavování povrchových komplexů spermií Han et al. nezávisle identifikovali alternativní multiproteinový komplex s chaperony na povrchu myších spermií. Zajímavé je, že jak bylo zdokumentováno výše, tento komplex složený z HSPA5, calnexinu, integrálního membránového proteinu 2B a ADAM7 se zřejmě sestavuje během kapacitace (Han et al. 2011). Zatímco funkce tohoto komplexu ještě nebyla plně objasněna, exprese ADAM7 byla spojena s přítomností dalších proteinů ADAM, ADAM2 a ADAM3 (Kim et al. 2006), které jsou důležité pro adhezi spermií k ZP (Muro & Okabe 2011). Kromě toho je známo, že HSPA5 se podílí na podpoře adheze kvalitních spermií k oviduktálním epiteliálním buňkám (OEC) v istmu samičího reprodukčního traktu. Předpokládá se, že tvorba tohoto rezervoáru má pro přežití spermií účinky ve smyslu udržení spermií v nekapacitním, klidovém stavu při přípravě na uvolnění oocytu do ampuly (Topfer-Petersen et al. 2002). Zajímavé je, že chaperony HSPD1 a HSPA5 byly rovněž lokalizovány na povrchu hovězích OEC, a byly tak zapojeny do vazby spermie-OEC (Boilard et al. 2004).

Také v souladu s naší prací je komplex identifikovaný Hanem et al. bylo prokázáno, že se nachází v membránových mikrodoménách nebo lipidových raftech, specializovaných oblastech membrány, které poskytují platformu pro funkční sestavení a prezentaci multiproteinových komplexů (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Rozdělení chaperonových komplexů do prostředí raftů bylo pozorováno také u HSPA2 v lidských spermiích (Nixon et al. 2011) a u složek komplexu CCT/TRiC v myších spermiích (Dun et al. 2011). Tyto membránové domény obsahuje také řada dalších domnělých ZP receptorových proteinů, včetně GALT1, ZP3R a SPAM1, což posiluje jejich roli v remodelaci povrchu spermií a ve vazbě ZP (obr. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Mechanismus (mechanismy), kterým se tyto proteiny rekrutují do lipidových raftů, dosud nebyl vyřešen; bylo však zjištěno, že HSPA2 se prostřednictvím své ATPázové domény váže na 3′sulfogalaktosylglycerolipid, hlavní glykoprotein identifikovaný v lipidových raftech spermie (Mamelak & Lingwood 2001).

Kromě předpokládané úlohy lipidových raftů při přemisťování klíčových chaperonových komplexů a proteinů ZP receptorů existují také přesvědčivé důkazy, že mnoho předpokládaných ZP receptorů, jako jsou ARSA a ZP3R, stejně jako několik molekulárních chaperonů vykazuje na kapacitaci závislé přemístění z intracelulárních míst, jako je akrozom, na povrch spermie, aby se buňky před interakcí se ZP připravily (Nixon et al. 2009). Bylo navrženo, že intimní kontakt mezi vnější akrozomální membránou a plazmatickou membránou spermie je zprostředkován vazbou komplementárních rozpustných proteinů SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), což vede k vytvoření fúzních pórů, které poskytují cestu pro migraci enzymů na povrch spermie před úplnou ztrátou obsahu akrozomu (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). Na podporu tohoto modelu studie Brahmaraju et al. (2004) prokázala, že podání protilátek proti VAMP a SNAP do akrozomálního vezikulu inhibovalo u myší vazbu spermie-ZP.

Tento postupný priming povrchu spermie vyvolal otázky týkající se povahy akrozomální exocytózy jako „vše nebo nic“. Nicméně se zdá, že funkční sestavení komplexů SNARE je také základem prodloužených událostí fúze membrán spermií, které umožňují úplnou ztrátu akrozomálního obsahu (Tsai et al. 2010). Ačkoli se obecně soudí, že kontakt se ZP iniciuje tuto akrozomální exocytózu u většiny savčích druhů, řada studií provedených na myších prokázala, že spermie, které zahájí akrozomální exocytózu před kontaktem se ZP, jsou stále schopny oplodnit oocyt (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Tento jev může platit i pro spermie morčat (Huang et al. 1981) a křečků (Yanagimachi & Phillips 1984). Tato zjištění naznačují důležitou roli kumulu ooforu při iniciaci akrozomové reakce a vyvolávají obavy ohledně schopnosti in vitro studií prováděných se strukturami oocytární zóny s kumulusem přesně informovat o skutečné povaze akrozomové reakce a vlastně i interakce ZP.

Nehledě na tyto kontroverze se molekuly podobné chaperonům také podílejí na akrozomální exocytóze díky své schopnosti podporovat sestavování SNARE obsahujících glutamin (Q-SNARE) a SNARE obsahujících arginin (T-SNARE) do těsných ternárních komplexů (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Je zajímavé, že elegantní studie na prasatech prokázaly, že kapacitace vyvolává stabilní spojení plazmatické membrány spermie s vnější akrozomální membránou v rámci přípravy na oplodnění (Tsai et al. 2010). Novější studie provedené Tsai et al. (2012) rovněž poskytly důkazy o přítomnosti unilamelárních smíšených vezikul, které kromě jiných důležitých funkcí umožňují nábor sekundárních ZP vazebných proteinů na povrchu spermie a disponují novým trimerním SNARE komplexem sestávajícím ze syntaxinu 3, SNAP23, VAMP2 a dalšího proteinu, komplexinu 2. Energie uvolněná při tvorbě těchto komplexů je následně využita k zahájení membránové fúze stažením plazmatické membrány a vnitřní akrozomální membrány spermie (Tomes et al. 2002). Dokončení tohoto procesu je rozhodující pro vystavení domén spermie, které se účastní následných událostí oplození: vazby oolemmy a fúze.

.