Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) avkok är en traditionell kinesisk medicinformel. Denna studie syftade till att undersöka effekten av XYS på kognitiva förmågor och dess underliggande mekanism hos ovariektomerade råttor. Sprague-Dawley-honorrar ovariektomiserades och behandlades med XYS (3 g/kg eller 9 g/kg) genom gavage, med subkutan injektion av 17-β-östradiol (E2, 2 μg/kg) som positiv läkemedelskontroll och gavage av 1 ml saltlösning (0,9 %) som placebokontroll. Efter 6 veckors behandling undersöktes råttorna med hjälp av Morris water maze-testet. Östradiolnivån i serum och hippocampus mättes med ELISA. Golgi-färgning utfördes för att observera neuronal morfologi i hippocampus. Apoptos av hippocampala celler observerades med TUNEL-färgning. Proteininnehållet av N-metyl-D-aspartatreceptor (NMDAR) 2A och 2B i hippocampus CA1-regionen bestämdes genom Western blot och immunohistokemi. Uttrycket av östrogenreceptor (ER) och PI3K-signalering påvisades genom Western blot. Jämfört med shamgruppen var både inlärning och minne försämrade hos ovariektomerade råttor. Råttor som behandlades med E2 eller högdos XYS visade bättre inlärning och minne jämfört med saltvattenbehandlade råttor. Högdos XYS minskade signifikant flyktlatenstiden i den rumsliga förvärvsförsöket; samtidigt ökade korsningstiderna och varaktigheten i sondkvadranten i den rumsliga sondförsöket. Högdos XYS främjade de novo-syntesen av E2-innehållet i hippocampus men hade ingen signifikant effekt på E2-nivån i serum. Golgi-färgning visade att högdos XYS kunde öka antalet grenar och tätheten av dendritiska ryggrader i hippocampus CA1-området. TUNEL-färgning visade att högdos XYS lindrade ovariektomiinducerad neuronal apoptos. Uttrycksnivån för NMDAR2A och NMDAR2B i hippocampal CA1 höjdes genom XYS-behandling. Den gynnsamma effekten av XYS var genom aktivering av ERα-PI3K-signalering. Sammanfattningsvis kan högdosbehandling med XYS förbättra de kognitiva förmågorna hos ovariektomerade råttor genom att skydda hippocampusneuronerna och återställa hippocampus E2-nivå.
1. Introduktion
Perimenopausala kvinnor lider ofta av ångest och depression relaterade till östrogennivåns fluktuation . Förutom ångest och depression är glömska ett annat vanligt klagomål hos perimenopausala kvinnor. Seattle Midlife Women’s Health Study rapporterade att 60 % av de medelålders kvinnorna noterade en försämring av minnet . I studien SWAN (Study of Women’s Health Across the Nation) konstaterades att perimenopausen var en beroende riskfaktor för självrapporterad glömska hos medelålders kvinnor . Eftersom hjärnan är ett viktigt mål för östrogenreglering spekuleras det att östrogenbrist kan vara ansvarig för den kognitiva försämringen. Resultaten från observationsstudier om påverkan på kognitionen är dock inte helt samstämmiga . Dessutom har effektiva terapeutiska hormoninterventioner för att förbättra den kognitiva prestandan ännu inte fastställts . Dessutom kan andra faktorer, t.ex. upplevd stress, humör och fysisk hälsa, också bidra till minnessymtom . Det är troligare att östrogenproduktionen i äggstockarna påverkar minnet vid en plötslig minskning än vid en naturlig övergång . I motsats till inkonsekvensen i studier på människor stöder resultaten från ovariektomerade djur sambandet mellan östrogenbrist och kognitiva förändringar och effektiviteten av hormonersättningsterapi .
Supplementering med fytoöstrogener är en populär alternativ terapi för att lindra symptomen av klimakteriet. Fytoöstrogener, såsom flavonoider, isoflavoner och lignaner, har en struktur som liknar steroidala östrogener och kan spela en östrogenliknande roll genom att aktivera östrogenreceptorer (ERs). En metaanalys stödde effektiviteten av tillskott av sojaisoflavoner för att förbättra det visuella minnet hos friska postmenopausala kvinnor . SWAN Phytoestrogen Ancillary Study visade att ett högt intag av isoflavon eller lignin kunde förbättra bearbetningshastigheten eller det verbala minnet i ett visst skede av klimakteriet, även om nyttan också var etnicitets-/rasrelaterad . Effekten av fytoöstrogener för att förbättra kognitionen är tydligare i djurstudier. Ett hydroalkoholiskt extrakt från bockhornsklöverfrön kunde dämpa ovariektomy- (OVX-) inducerade hippocampala neuronskador och förbättra inlärnings- och minnesprestanda i en råttmodell .
Xiao-Yao-San (XYS), som betyder lyckligt och bekymmersfritt pulver på kinesiska, är en traditionell kinesisk medicinformel (TCM) som används för att behandla menopausal ångest och depression. Formeln består av Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizom macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe) och Glycyrrhizae radix (Gancao). En systematisk analys som omfattade 26 randomiserade studier visade att XYS var överlägsen antidepressiva medel, vilket indikerades av poäng på Hamiltons depressionsskala, och kunde öka effekten av antidepressiva medel när det gällde att förbättra poäng på självskattningsskalan för depression . Perimenopausala kvinnor med exoftalmi och palpitation kan också dra nytta av XYS-behandling . Vissa terapeutiska effekter av XYS för att lindra menopausala syndrom kan tillskrivas förekomsten av fytoöstrogener. Ett antal studier har rapporterat om förekomsten av fytoöstrogener i XYS. Ergosterol finns i Poria cocos (Fuling) , och β-sitosterol är känt för att finnas i Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini et al. har utvecklat en östrogen-chimerisk receptor/Gal4-responselementreglerad/luciferase-reporteranalys för att påvisa förekomsten av fytoöstrogener i komplexa TCM-formler. De analyserade Bupleurum & Peony Formula, en modifierad formel av XYS med samma huvudörter och fann ett mätbart innehåll av fytoöstrogener .
Närvaron av fytoöstrogener i XYS tyder på att XYS har potential att behandla kognitiv nedsättning orsakad av östrogenbrist. En djurstudie visade att XYS kunde dämpa kronisk immobiliseringsstress (CIS) inducerad inlärning och minnesunderskott . För närvarande har ingen studie utvärderat effekten av XYS för att förbättra kognitiv nedsättning hos perimenopausala kvinnor. Därför undersöktes i den aktuella studien effekten av XYS på kognitiva förmågor och dess underliggande mekanism hos OVX-råttor.
2. Material och metoder
2.1. Djur och behandling
Totalt användes 60 kvinnliga Sprague-Dawley råttor i denna studie. Studieprotokollet godkändes av institutionens etiska kommitté för försöksdjur (godkännandenummer: ACU170802). Djuren inhystes med fri tillgång till vatten och standardfoder under kontrollerad temperatur och luftfuktighet. Råttorna delades slumpmässigt in i 5 grupper (12 råttor/grupp): shamgrupp, OVX + koksaltlösning eller O-koksaltlösning, OVX + 17-β-östradiol (E2) eller O-E2-grupp, OVX + XYS 9 g/kg eller O-XYS9-grupp och OVX + XYS 3 g/kg eller O-XYS3-grupp. Råttorna genomgick OVX-operation under anestesi enligt tidigare beskrivning . Kortfattat gjordes ett längsgående snitt i en tredjedel av bålen och 1-2 cm från varje sida av ryggraden. Fettvävnaden drogs försiktigt ut med en pincett. Äggstocken identifierades och livmoderhornen ligerades. Äggstocken avlägsnades och buksnittet syddes. I shamgruppen snittades buken utan OVX.
Behandlingen inleddes två veckor efter OVX-operationen och pågick i sex veckor. Råttorna i XYS-behandlingsgrupperna fick XYS genom gavage-nål i en daglig engångsdos på 9 g/kg eller 3 g/kg. Subkutan injektion av E2 (2 μg/kg) sattes in som en positiv läkemedelskontroll. Gavage av 1 ml saltlösning (0,9 %) användes som placebokontroll. XYS-avkoket användes i form av ett extrakt (1 g/ml, motsvarande 1 g rå örter/ml), som tillhandahölls av det anslutna sjukhuset vid Nanjing University of Traditional Chinese Medicine. Formeln för XYS-avkoket har rapporterats i förväg. Den dos av XYS som används på kliniken för perimenopausala kvinnor är 175 g rå örter/60 kg, vilket motsvarar 3,5 g/kg hos råttor. Med hänvisning till andra experimentella rapporter om råttmodellen fastställde vi den låga dosen till 3 g/kg och den höga dosen till 9 g/kg . E2-pulver (kat. nr E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) löstes upp i en liten mängd etanol, och sedan bereddes 20 μg/ml strumplösning med 0,9 % saltlösning.
2.2. Morris Water Maze Test
Inlärnings- och minnesfunktionen hos råttor bedömdes med hjälp av Morris water maze (MWM) testet . MWM-försöksutrustningen är en rund bassäng (200 cm i diameter) med 38-40 cm högt vatten. Vattentemperaturen hålls konstant på 20-22 °C. MWW-testet består av tre delar, nämligen försöket för rumslig inlärning (som varar i fem dagar), försöket för rumslig sondering och försöket för synlig plattform. I försöket med rumsligt förvärv placerades råttorna försiktigt i en slumpmässig kvadrant av vattentanken med plattformen dold 1,5 cm i den nordöstra kvadranten under vattnet. Varje råtta fick simma i upp till 60 s för att hitta plattformen. Råttor som inte hittade plattformen inom 60 s guidades till den och latensen registrerades som 60 s. Flyktlatensen registrerades av ett videoanalyssystem (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). Råttorna tränades fyra gånger per dag. Efter 5 dagars träning fick råttorna ta del av det rumsliga sondförsöket där plattformen avlägsnades från den nordöstra kvadranten. Råttorna placerades på samma startplats i den nordvästra kvadranten. Råttornas reseavtryck som sökte efter plattformen under 120 s registrerades. Varaktigheten och korsningstiderna i målkvadranten beräknades för att bedöma bevarandet av det rumsliga minnet. Nästa dag efter det rumsliga sonderingsförsöket fick råttorna ett försök med synlig plattform som liknade träningen med dold plattform, där plattformen höjdes 1,5 cm över vattenytan och placerades i den sydvästra kvadranten. Varje råtta släpptes ut 4 gånger, och varje gång från en annan ingångspunkt. Flyktlatency, simdistans och simhastighet registrerades.
2.3. Provtagning
När MWM-testet var avslutat thorakotomiserades råttorna och intuberades i stigande aorta via vänster kammare under bedövning med natriumpentobarbital (40 mg/kg via intraperitoneal injektion). Stamblod samlades upp med hjälp av ett serumseparatorrör för detektion av E2. Hippocampi från sex råttor separerades från hjärnbarken och omgivande hjärnvävnader, avlägsnades snabbt, tvättades med kall PBS och frystes i flytande kväve för detektion av E2 och Western blot. Tre oparfuserade hjärnvävnader immobiliserades i 4 % paraformaldehyd i 24 timmar och användes för Golgi-färgning och immunohistokemi. De tre kvarvarande råttorna transkardialt perfunderades med kall saltlösning, följt av fixering i 4 % paraformaldehyd i 1 h. Hjärnorna avlägsnades sedan, fixerades i 4 % paraformaldehyd i 24 h och bäddades in i paraffin för TUNEL-färgning.
2.4. E2-detektion
Blodprover fick koagulera vid rumstemperatur och centrifugerades i 15 minuter vid 4 °C för att separera serum. Hippocampusvävnader vägdes, homogeniserades i kall saltlösning och centrifugerades i 20 minuter för att samla upp supernatanten. E2-innehållet i serum och hippocampushomogenatets supernatant påvisades med ELISA-kit (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina).
2.5. Golgi-färgning
Hippocampus skars i små block och bearbetades för Golgi-färgning enligt beskrivningen . I korthet sänktes hippocampusblocken i Golgi-färgningslösning (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Kina) i 14 dagar, under vilka färgämneslösningen byttes ut var 2-3:e dag. Vävnaderna dehydratiserades med 30 % sackaros och sektionerades på 100 μm. Sektionerna behandlades med etanoldehydrering, klargjordes med xylen och monterades på gelatinbelagda objektglas. Golgi-färgning utfördes framgångsrikt i alla prover. Neuronernas morfologi i hippocampus observerades i ljusmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan). Neuronerna i CA1-regionen i hippocampus analyserades med hjälp av Neuron J plugged i Image J-programvaran. Fem sektioner valdes ut för varje råtta, och dendritiska taggar med fullständig morfologi valdes ut för varje sektion . Tätheten och grenpunkterna hos de dendritiska ryggarna mättes.
2.6. Immunohistokemi
Expressionen av N-metyl-D-aspartatreceptor (NMDAR) underenheterna 2A och 2B i hippocampus bestämdes genom immunohistokemi enligt standardförfarandet . De primära antikroppar som användes var kanin anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Kina) och kanin anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Kina). Den sekundära antikroppen var HRP-konjugerad antikanin IgG (Servicebio).
2.7. TUNEL-färgning
De morfologiska förändringarna i hippocampus upptäcktes genom TUNEL-färgning med ett kommersiellt kit (Roche, Mannheim, Tyskland) enligt instruktionerna. Sektionerna genomgick DAB-kolorimetrisk reaktion följt av hematoxylinfärgning. Kärnan i TUNEL-positiva apoptotiska celler var brun i ljusmikroskop. Fem sektioner valdes ut för varje råtta och tre icke-repetitiva fält (400x förstoring) valdes ut för varje sektion. Procentandelen TUNEL-positiva celler i alla celler beräknades.
2,8. Western Blot
Den hippocampala CA1-hjärndelen extraherades snabbt och klipptes i små sektioner enligt hjärnatlaset. Hippocampusvävnader inkuberades över natten med RIPA-lysisbuffert (innehållande 100 Mm PMSF, köpt från Servicebio). Cellrester avlägsnades genom centrifugering i 10 minuter för att samla upp den proteinhaltiga supernatanten. Proteinkoncentrationen bestämdes med hjälp av BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinlysat (30 μg/lane) separerades med 10 % SDS-PAGE och elektroplotterades på PVDF-membran. Efter att ha blockerats med 5 % fettfri mjölk provades membranet över natten med följande primära antikroppar: kanin anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), kanin anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), kanin anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), kanin antiERα (1 : 2000, Millipore), kanin mot fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), kanin mot fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), kanin mot Bax (1 : 1000, Abcam), kanin mot Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) och kanin mot GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH påvisades som intern kontroll. Därefter provades membranet med sekundärt pepparrotsperoxidas- (HRP-) konjugerat get-antikanin-IgG (1 : 5000, Bioworld) i 1,5 h. Banden visualiserades med kemiluminiscensmetoden. Den genomsnittliga optiska densiteten för proteinbanden kvantifierades med programmet Image J.
2.9. Statistisk analys
De experimentella uppgifterna analyserades med programvaran GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA). Numeriska data uttrycktes som medelvärde ± SD. Skillnaden mellan två grupper jämfördes med t-test. Resultaten av försöket med dold plattform analyserades med grupp × dag ANOVA med upprepade åtgärder följt av Tukey’s post hoc. Andra multipla jämförelser analyserades med envägs ANOVA följt av Tukey’s post hoc. värde < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.
3. Resultat
3.1. Xiao-Yao-San avkok förbättrar rumslig inlärning och minnesförmåga hos ovariektomerade råttor
Inlärningsförmågan bedömdes först med hjälp av ett försök med rumslig förvärvning. ANOVA med upprepade åtgärder visade att både behandlingen och träningsdagarna påverkade flyktlatensiteten (figur 1(a)). Flyktlatensen i alla grupper minskade med ökningen av träningsdagar (), och skillnaden var också signifikant i trenden för latensminskning inom varje grupp (). Det fanns ingen interaktion mellan behandling och träningsdagar (). Under de två första träningsdagarna observerades ingen signifikant skillnad i flyktlatensen i varje grupp. Från och med den tredje träningsdagen var flyktlatensen signifikant längre än i shamgruppen; flyktlatensen i E2- och högdos XYS9-gruppen var kortare än i saltlösningsgruppen, men skilde sig inte från den i shamgruppen. Efter 5 dagars träning bedömdes råttorna med sondförsök för att testa det spatiala minnet. Som framgår av figur 1(b) var korstiderna, varaktighetstiden och procentandelen av varaktighetstiden i sondkvadranten signifikant reducerade i saltlösningsgruppen. Ingen skillnad observerades i varaktighetstiden i andra kvadranter. Behandling med XYS eller E2 kunde påtagligt återställa korstiderna och varaktighetstiden i sondkvadranten till samma nivå som i shamgruppen. För att utesluta effekterna av miljöfaktorer och försöksdjurens kognitiva och aktivitetsnivåer på rumslig inlärning och minne genomgick råttorna också försöket med synlig plattform (figur 1 c)). Det fanns ingen signifikant skillnad i flyktlatenstid, simdistans och simhastighet mellan grupperna. Sammantaget tyder dessa resultat på att den spatiala inlärningen och minnet var nedsatt hos OVX-råttor, och behandling med högdos XYS kunde effektivt förbättra de nedsatta kognitiva funktionerna.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.2. Xiao-Yao-San avkok ökar hippocampala östrogeninnehållet hos ovariektomerade råttor
Nästan studerade vi effekten av XYS på östrogennivån hos OVX-råttor. Som framgår av figur 2(a) förbättrade XYS-behandlingen inte den serumöstradiolnivå som minskat på grund av OVX; det fanns dock ingen signifikant skillnad i serumöstradiolnivåerna mellan sham- och OVX-behandlingsgrupperna. Noterbart är att högdos XYS och E2 ökade hippocampus östradiolnivåerna jämfört med saltlösning (figur 2(b)). O-XYS3-gruppen hade fortfarande lägre hippocampala östradiolnivåer än shamgruppen. Förändringen av hippocampus E2-innehållet kan inte förklaras av förändringen av det gonadavledda E2-innehållet, utan av förändringen av in situ-syntesen. Därför upptäckte vi uttrycket av CYP19, det sista enzymet i östrogen-syntesen, i hippocampus. Resultaten visade att behandling med XYS eller E2 kunde öka uttrycket av CYP19 jämfört med saltlösningsgruppen (), men endast skillnaden mellan högdos XYS- och saltlösningsgruppen var signifikant (). Behandlingen återställde inte CYP19-nivån till den i shamgruppen. Resultaten tyder på att XYS främjade uttrycket av aromatas i hippocampus och därmed ökade de novo-syntesen av E2.
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
3.3. Xiao-Yao-San avkok minskar neuronal skada i hippocampus hos ovariektomerade råttor
Cellmorfologin i hippocampus, särskilt i CA1-regionen, spelar en viktig roll för den kognitiva förmågan . Cellmorfologin i hippocampus analyserades genom Golgi-färgning, vilket visas i figur 3(a). Jämfört med sham-gruppen minskade antalet neuroner i saltlösningsgruppen avsevärt, och morfologin hos dendritiska taggar var skadad. Ytterligare analys av CA1-neuronerna visade att antalet neuroner och tätheten av dendritiska ryggrader minskade avsevärt i saltlösningsgruppen (figurerna 3(b) och 3(c)). Högdosbehandling med XYS ökade neuronantalet i hippocampus och ökade punktantalet av neuroner och ryggradstätheten i CA1-regionen. E2-behandling hade samma terapeutiska effekt som högdos XYS. Lågdos XYS förbättrade dock inte effektivt neuronskador i hippocampus CA1-regionen. På samma sätt minskade apoptosen av hippocampala (CA1, CA3, DG) neuroner med hög dos XYS eller E2-behandling (figur 4). Lågdos XYS kunde dock endast minska apoptosen hos CA3-neuronerna, men hade ingen effekt på CA1- och DG-neuronerna. Sammantaget kunde högdos XYS minska neuronskadorna i hippocampus, särskilt i CA1-regionen.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Xiao-Yao-San avkok ökar hippocampalt uttryck av NMDAR2A och NMDAR2B hos ovariektomerade råttor.
Synaptisk plasticitet är den neurobiologiska grunden för långtidsinlärning och långtidsminnet, och prestationen i MWM-testet påverkas av NMDAR-funktion . Därför uppskattade vi ytterligare uttrycket av NMDAR-underenheterna 2A och 2B i hippocampus CA1. Western blot (figurerna 5(a) och 5(b)) visade att uttrycket av NMDAR2A och NMDAR2B var minskat hos OVX-råttor. Behandling med XYS eller E2 ökade signifikant uttrycksnivån för dessa två proteiner till samma nivå som i shamgruppen. Immunohistokemi (figur 5(c)) visade också att andelen positivt färgade celler ökade i behandlingsgrupperna. Jämfört med saltvattengruppen ökade högdos XYS signifikant uttrycket av både NMDAR2A och NDMAR2B ( respektive 0,013), men lågdos XYS kunde endast signifikant öka uttrycket av NMDAR2A ().
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3,4. Xiao-Yao-San avkok aktiverar PI3K-signalvägen genom ERα
Effekten av E2 eller fytoöstrogener på fysiologi medieras av ER-signalering. Studier har visat att aktivering av extracellulärt signalreglerat kinas (ERK), ett mitogenaktiverat proteinkinas, är nödvändigt för de positiva effekterna av E2 på minnet . Fosforyleringen av ERK1/2 är beroende av aktiveringen av PI3K . Därför undersökte vi effekten av XYS på ER-PI3K-signalering. Som framgår av figur 6 främjade högdos XYS och E2 signifikant uttrycket av ERα, fosforylerat ERα (Ser118) och PI3K p110β (den katalytiska underenheten) jämfört med saltvattengruppen. Aktivering av ERα-PI3K minskade ytterligare uttrycket av den proapoptotiska faktorn Bax och ökade uttrycket av den antiapoptotiska faktorn Bcl-2. Lågdos XYS påverkade dock inte ERα-PI3K-signalering signifikant, vilket stämmer överens med resultaten i figurerna 3 och 4.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Diskussion
XYS har länge använts för att behandla perimenopausal ångest och depression. Vår studie utforskade den nya tillämpningen av XYS vid behandling av OVX-inducerad kognitiv försämring. Resultaten visade att XYS effektivt förbättrade rumslig inlärning och rumsligt minne hos OVX-råttor. Den möjliga mekanismen är att XYS främjar de novo-syntesen av östrogen i hippocampus, vilket aktiverar ERα-PI3K-signalvägen och hämmar apoptos av hippocampala neuroner.
Den underliggande mekanismen för XYS för behandling av depression har studerats ingående. XYS spelar en antidepressiv roll genom att reglera ett omfattande nätverk som involverar neurotransmittorer, neurotrofiner, hypotalamus-hypofys-binjureaxeln, aminosyror och lipider . Några av dessa studier har visat att XYS kan verka på förändringar i hjärnan i samband med stress. In vitro-analyser visade att ett XYS-innehållande serum kunde vända förändringen av mitokondriernas membranpotential, koncentrationen av fritt kalcium och apoptosfrekvensen hos neuroner som inducerats av oxidativ stress . Vår studie visade att XYS också dämpade neuronal apoptos i hippocampusregionen hos OVX-råttor. De antiapoptotiska effekterna av XYS tyder på att det hade potential att verka på en mängd olika patologiska processer relaterade till hjärnans neuronala apoptos.
Resultaten av vår studie visade att XYS kunde återställa östrogennivån i hippocampus hos OVX-råttor. Hippocampus är viktigt för minnesbildning och är rik på ERs, och östrogen underlättar högre kognitiv och synaptisk hälsa via dessa ERs . Flera kliniska prövningar visade på effektiviteten av hormonersättningsterapi på kognitiva symtom relaterade till östrogenförlust hos kvinnor . XYS skulle kunna öka östradiolnivån i hippocampus, vilket borde vara den avgörande grunden för dess effektivitet när det gäller att förbättra de kognitiva förmågorna hos OVX-råttor. XYS ökade dock inte serumöstradiolnivån. Detta kan bero på att östradiol kan syntetiseras de novo i hippocampus, medan serumöstradiol kommer från gonaderna . Våra resultat visade att XYS ökade uttrycket av CYP19 i hippocampus, vilket tyder på att det ökade E2 i hjärnan sannolikt härrörde från hippocampus . Resultaten av vår studie visade att XYS uppreglerade uttrycket av NMDAR2A och NMDAR2B i hippocampus hos OVX-råttor. Detta resultat överensstämde med tidigare studier. Östrogen visade sig öka både dendritisk ryggradstäthet och synapsantal i hippocampus genom att modulera NMDAR-funktioner hos OVX-råttor . Östrogen kan också återställa hippocampusneuronernas morfologi hos åldrade råttor genom att återställa NMDAR2B-nivån till den som sågs i unga nivåer i CA1-regionen; dessutom kan östrogen påverka rörligheten hos NMDAR2A och NMDAR2B över synapsen . Aktivering av NMDAR kan i sin tur bidra till syntesen av hippocampalt E2 genom att inducera Ca2+-inflöde .
Förutom NMDARs kan XYS reglera uttrycket av andra kognitionsrelaterade faktorer i hjärnan. Förlust av postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD-95), synaptofysin och hjärnavledd neurotrofisk faktor (BDNF) i hippocampus har direkt korrelerats med inlärnings- och minnesbrister . Effekten av XYS hos CIS-råttor har varit relaterad till att främja uttrycket av PSD-95 och synaptofysin i hippocampus . XYS har också visat sig uppreglera BDNF i frontalcortex, hippocampus CA1-regionen och amygdala hos CIS-råttor . Under CIS-behandlingsprocessen av XYS inhiberades c-Jun N-terminalt kinas (JNK) signalväg i hippocampus .
Och även om vi inte specifikt har undersökt vilken komponent som är den huvudsakliga aktiva av XYS på inlärning och minne, tyder våra resultat på att huvudkällan av fytoöstrogener i XYS är en kandidat som förtjänar att undersökas ytterligare. Forskningen om antidepressiva medel kan också ge oss några ledtrådar. Jiali Liu et al. upptäckte att Bupleuri radix (Chaihu) är det huvudsakliga antidepressiva läkemedlet i XYS-receptet baserat på serumfarmakokemisk analys av petroleumeterfraktionen . En in vitro-studie visade att Bupleuri radix-extrakt främjade spridningen av neuroblastomceller genom att aktivera PI3K/AKt-vägen . Aktiveringen av PI3K observerades också i vår studie. .
Aktuella kliniska rapporter visar att XYS har en betydande antidepressiv terapeutisk effekt, men det finns ingen tydlig toxikologisk studie om toxicitet och biverkningar av XYS i detalj. Generellt sett kan XYS betraktas som ett recept utan alltför många biverkningar. XYS har flera modifierade recept vars grundingredienser är desamma som för XYS. I en nyligen genomförd metaanalys bedömdes effektiviteten och säkerheten hos modifierad XYS vid behandling av perimenopausalt syndrom. De sammanlagda resultaten tyder på att modifierad XYS kan vara effektivare och säkrare för behandling av perimenopausalt syndrom jämfört med hormonersättningsterapi . På grund av den bristfälliga metodiken i de inkluderade studierna krävs dock mer rigorösa studier för att bekräfta XYS:s effektivitet och säkerhet. Med hjälp av 1H-kärnmagnetisk resonans (NMR) rapporterade Xiaoxia Gaos forskargrupp att petroleumeterfraktionen som innehåller lipofila komponenter var den mest effektiva fraktionen för behandling av depression . De rapporterade också att Bupleuri Radix, den viktigaste antidepressiva komponenten, kunde ge mer toxiska effekter i levern eller njurarna hos friska råttor än hos råttor med kronisk oförutsägbar mild stress. De toxiska effekterna var förknippade med ökad gallsyrakoncentration, underlättande av lysinnedbrytning och metabolisk störning av sfingolipid, glycerofosfolipid och fettsyror . Detta resultat bekräftades i en nyligen genomförd metabolomisk studie av patienter med depression. XYS spelade en antidepressiv roll genom att reglera syntesen av leucin, valin och isoleucin och metabolismen av binärsyra, fettsyra, argin och prolin . Dessa studier tyder på att det är nödvändigt att noga övervaka patientens status med snabb justering av läkemedelsdosen för att förhindra toxiska biverkningar.
5. Slutsatser
I den här studien visade vi att behandling med högdos XYS hade liknande effekt som E2 för att förbättra de kognitiva förmågorna hos OVX-råttor. Den terapeutiska effekten medierades genom att skydda hippocampala neuroner och återställa den hippocampala E2-nivån. ERα-PI3K-signalvägen var involverad i processen. Vår studie tyder på att XYS skulle kunna vara ett alternativ för behandling av perimenopausal kognitiv försämring. För närvarande används XYS huvudsakligen för behandling av klinisk ångest och depression. Fler kliniska data behövs för att verifiera dess effekt på att förbättra den kognitiva funktionen.
Datatillgänglighet
Data som används för att stödja resultaten i denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter i någon form.
Författarnas bidrag
Lina Liu och Fei Ge bidrog i lika stor utsträckning till den här forskningen.
Acknowledgments
Den här forskningen har fått stöd från Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795 och 81903974), Jiangsu-provinsens naturvetenskapliga stiftelse (bidrag nr BK20181235), Jiangsu-provinsens byrå för traditionell kinesisk medicin (bidrag nr YB2017066), Nanjing Science and Technology Development Plan Project (bidrag nr YB2017066), Nanjing Science and Technology Development Plan Project (bidrag nr YB2017066). 201715072), projektet för Jiangsu-provinsens sjukhus för kinesisk medicin (bidrag nr Y2018CX09) och ett projekt finansierat av Jiangsu Higher Education Institutions prioriterade akademiska programutveckling.