I den här studien antog vi att olika metoder för RNA-isoleringen kommer att påverka resultaten vid analys av genuttryck i vävnader. RNA-extraktionsmetoder kan i stort sett karakteriseras som antingen fenol:kloroformextraktion följt av alkoholfällning (TRIzol), fenol:kloroform följt av extraktion i fast fas (kolonnbaserad; miRVana och miRNeasy) och separering i fast fas med/utan affinitetsharts (Norgen total och Isolate II). Dessa metoder har i första hand utvecklats för extraktion av långa mRNA och bygger på antagandet att alla RNA renas lika mycket. Dessutom finns det ett antal överväganden för att välja en viss RNA-extraktionsmetod, t.ex. kvalitet, kvantitet, pris och användarvänlighet (tid till extraktion). Här presenterar vi data som visar att den metod som används för att extrahera RNA också kommer att ge varierande resultat jämfört med olika metoder i tillämpningar i efterföljande led och är därför ytterligare ett viktigt övervägande.
Denna studie visar att RNA-isoleringsmetoderna varierar när det gäller kvantitet och kvalitet på RNA-proverna och i analysen av miRNA- och målgenuttryck. Vi valde organ som kan vara svåra att isolera RNA från av olika skäl. Till exempel noteras ofta att RNA-isolering från hjärna resulterar i låga utbyten på grund av dess höga lipidinnehåll. Detta var särskilt tydligt med Bioline Isolate II-kitet. I tillverkarens protokoll anges att upp till 5 μg RNA bör renas från 10 mg hjärna från råtta/mus. I miRNeasy-handboken anges dock att 5-20 μg RNA bör kunna erhållas från hjärnan med samma mängd insatsmaterial. Problemlösning på tillverkarens webbplats beskriver att ett problem med lipidrika vävnader är igensättning av kolonnen och föreslår att provmängden minskas eller att volymen av lysisbufferten ökas. Våra extraktioner utfördes inom de föreslagna gränserna i protokollet. Därefter föreslår de att man utför förextraktion med hjälp av TRIsure-reagens (Biolines motsvarighet till TRIzol) och sedan kolonnbaserad separation med kitet för att rensa upp den vattenhaltiga fasen. Denna metod skulle då vara jämförbar med miRVana- och miRNeasy-metoderna för RNA-extraktion och kan resultera i bättre resultat för denna vävnad. Dessutom korrelerar RNA-kvaliteten med vävnadsspecifika reaktioner på fysiologisk stress både före och efter vävnadsdöd. Vävnader som lungor och lever har karakteristiskt låga RIN-värden och en liten 28S-topp eftersom dessa vävnader är utsatta för snabbare nedbrytning av RNA genom höga nivåer av nukleaser. För att inaktivera nukleaser fryses vävnaden snabbt och tinning förhindras tills det vägda materialet tillsätts till extraktionsbufferten. Även om vävnaden inte tinades upp kan vi inte utesluta att tiden från det att djuret avlivades och organen avlägsnades till snabb nedfrysning är en bidragande faktor till de totalt sett låga RIN-värdena och vissa nedbrytningsprodukter som observerades för alla lungprover, oavsett vilket isoleringskit som användes. En alternativ metod för att inaktivera nukleaser är att använda en RNA-stabiliserande lösning som RNAlater (ThermoFisher Scientific), vilket gör det möjligt att bearbeta ofrusna vävnadsprover senare. Den kan bidra till att säkerställa RNA:s integritet, men den är inte kompatibel med alla RNA-isoleringsförfaranden och användarna bör kontrollera sin specifika metod innan de utför extraktioner. Tillägget av en topp efter 60 s i vissa prover i Bioanalyser-analysen tyder på gDNA-kontaminering. En ytterligare DNAS-behandling kan utföras på kolumnerna med vissa kit, men ett steg för eliminering av gDNA rekommenderas starkt under steget för omvänd transkription. Införandet av detta steg i våra metoder kan förklara varför det inte förekom någon störning vid analysen av mRNA-uttrycket i Norgen-lungproverna, men det påverkade analysen av miRNA-uttrycket eftersom protokollet för Taqman miRNA-analysen inte omfattar avlägsnande av gDNA. Vidare är renheten hos RNA-proverna en kritisk faktor eftersom även om prover med RIN > 7 bör fungera okej i de flesta tillämpningar i efterföljande led, kan prover som involverar enzymatiska reaktioner, t.ex. qPCR, hämmas av nukleaser, metalljoner eller organiska föroreningar. Generellt sett hade Bioline Isolate II RNA-proverna lägre 260/230-förhållanden och föroreningar kan bidra till dess dåliga prestanda. Slutligen observerades skillnader i anrikningen av miRNA i det totala RNA-preparatet. Eftersom miRNAs utgör en liten del av den totala RNA-repertoaren kan det vara svårt att fastställa deras bidrag från integritetsanalysen. Qubit microRNA-analysen erbjuder mycket selektiv detektion av små mängder små RNA även i närvaro av vanliga föroreningar. Höga procentsatser av miRNA upptäcktes vanligen med miRVana- och Norgen-extraktionsmetoderna, men med tanke på integritetsanalysen för Norgens totala RNA-preparat är det möjligt att miRNA-anrikningen kan överskattas eftersom mindre RNA-fragment upptäcks till följd av nedbrytning eller oxidation av större RNA:er (mRNA:er, rRNA:er eller tRNA:er) eller, i fallet med lungproverna, DNA-kontaminering som stör Qubit-resultaten. Kvantitet, kvalitet och renhet hos RNA-proverna är därför mycket viktiga faktorer när man väljer en viss RNA-extraktionsmetod, och ytterligare forskning om hur man optimerar dessa metoder för den aktuella vävnaden kan bidra till att förbättra dessa.
Profilering av miRNA kan ge insikt om biomarkörer för diagnostiska eller prognostiska tillämpningar. Paneler av miRNAs kan till exempel användas för att klassificera olika cancerfenotyper, förutsäga återfall eller respons på terapier . För upptäckt och klinisk tillämpning av miRNA-baserade biomarkörer måste det dock finnas optimerade och standardiserade metoder för hur RNA extraheras för att förhindra motstridiga resultat. I en metaanalys av 63 publicerade studier av Zhou et al. (2014) fann man t.ex. inkonsekventa och till och med kontrasterande resultat vid bedömningen av det prognostiska värdet av oncomiR, miR-21 . Författarna tillskriver heterogeniteten skillnader i källan till proverna, detektionsmetoderna och normaliseringsmetoderna, men anspelade inte på metoderna för att extrahera RNA, vilket vi visar också bidrar.
De biologiska funktionerna och måltavlorna för mycket få miRNA har validerats experimentellt, men detta är avgörande för att förverkliga potentialen hos miRNA-baserad terapi. Dessutom kommer avslöjandet av vävnadsspecifika biologiska funktioner att hjälpa till att identifiera deras terapeutiska verkan och potentiella off-target-effekter i normala vävnader. Validering av miRNA-mRNA-interaktioner utförs i första hand i cellodlingsförsök, vilket innebär artificiell manipulation av endogena miRNA:er. De nivåer som uppnås genom manipulation i cellkultur (t.ex. transfektion av mimiska substanser) motsvarar dock vanligtvis inte de fysiologiska nivåer som observeras in vivo, varför det är viktigt att återskapa resultaten i lämpliga djurmodeller. För närvarande finns det inga rapporter som direkt jämför miRNA- och målgenupptäckt från totala RNA-prover med hjälp av olika extraktionsmetoder. Vi visar att RNA-extraktionsmetoderna skiljer sig åt i effektivitet när det gäller att isolera både korta och långa RNA och därför måste man noga överväga att välja en lämplig metod om man vill detektera båda från samma prov.
I tidigare forskning har man vanligen utgått från att alla typer av RNA renas lika mycket. Det har dock framkommit flera rapporter som visar på skillnader i extraktionseffektivitet beroende på vilken metod som används för RNA-isolering. Kim et al. (2011) drog tillbaka sin artikel i Molecular Cell eftersom de fann att deras slutsatser om skillnader i miRNA-uttryck från celler som odlats vid olika konfluensa (hög densitet jämfört med låg densitet) och när de lossnade från odlingsskålen (adherent jämfört med suspension) i själva verket förklarades av skillnader i RNA-extraktionseffektivitet med hjälp av TRIzol-metoden . De fann att miRNA med lågt GC-innehåll och stabil sekundärstruktur förlorades under extraktionen, snarare än att de bröts ner i cellerna, vilket de ursprungligen hade publicerat . Tidigare resultat från El-Khoury et al. (2016) fann skillnader i miRNA-återvinning från celler, plasma och exosomer från urin/plasma när man jämförde TRIzol LS, miRNeasy serum/plasma och miRCURY biofluid-extraktionskit . Författarna fann att miRCURY-kitet isolerade mycket rent RNA men återfann miRNA:er dåligt, TRIzol gav RNA med låg renhet vilket påverkade PCR-effektiviteten, medan miRNeasy gav RNA av dålig kvalitet men var bäst för miRNA-detektion. På samma sätt fann McAlexander et al. (2013) skillnader i miRNA-extraktion från plasma och cerebrospinalvätska. De jämförde miRVana, miRCURY Cell and Plant kit och TRIzol LS extraktioner med och utan glykogen som bärare. miRVana var likartad med eller utan glykogen, medan miRCURY utan glykogen hade något lägre miRNA-återvinning än miRVana. Glykogen förbättrade dock avsevärt miRNA-återvinningen med miRCURY-kitet men förvärrade det låga utbytet och variabiliteten med TRIzol-extraktion. De fortsatte sedan med att jämföra miRCURY Cell and Plant kit med miRCURY Biofluids och miRNeasy serum-/plasmaextraktionsmetoder med glykogen som bärare och fann att miRCURY Biofluids hade den högsta relativa abundansen av spikat exogent miRNA och drog slutsatsen att detta var den överlägsna metoden för deras särskilda tillämpning. Sammantaget belyser dessa studier skillnaderna i RNA-återvinning med hjälp av olika extraktionsmetoder och visar på behovet av att optimera för din cell, vävnad och/eller vätska av intresse.
Det finns flera steg under arbetsflödet som kan introducera experimentell variation. Det börjar med metoden för fixering eller frysning av vävnaden, lagring av materialet, RNA-extraktionsmetod, metod som används för omvänd transkription och qPCR-amplifiering eller andra plattformar i efterföljande led. I den här studien har vi försökt kontrollera några av dessa variabler genom att snabbfrysa vävnaderna, förvara dem vid – 80 °C, förhindra upptining före extraktion och använda de mest rekommenderade metoderna för miRNA-uttrycksanalys. Till exempel har det visat sig att användningen av sekvensspecifika RT-primers i motsats till en universell RT-primer är överlägsen för specifik produktamplifiering . qPCR anses vara den gyllene standarden för analys av miRNA- och målexpression på grund av dess känslighet och specificitet jämfört med globala profileringsplattformar. Det är viktigt att kvaliteten på de erhållna resultaten är viktigare än själva antalet miRNA-profiler från stora sekvenseringsbaserade plattformar. Även om vi inte jämförde effekten av miRNA-anrikning från våra RNA-prover har tidigare rapporter avrått från detta, särskilt när det gäller globala miRNA-profileringsplattformar. Till exempel fann Redshaw et al. (2013) att förfarandet för anrikning av kort RNA resulterar i betydligt lägre relativa miRNA-nivåer när man jämför totalt RNA och anrikat material, specifikt minskade anrikningsförfarandet kopieringsantalet av miRNA med upp till 25 % av det som fanns i de föranrikade proverna och att denna förlust varierade för olika miRNA-sekvenser. Därför är det möjligt att miRNA-data från totala och korta RNA-preparat inte är direkt jämförbara. Dessutom har det föreslagits att större RNA kan fungera som bärare av små RNA. Huruvida miRNA-berikade metoder för alla företag skulle resultera i bättre återvinning från vävnader återstår att fastställa. Även om Bioline föreslår ett separat kit för miRNA-isolering använde vi Isolate II total RNA-kitet för att direkt jämföra med andra extraktionsmetoder, eftersom det miRNA-specifika kitet inte tillåter isolering av både korta och långa RNA från samma eluering. Snarare anrikas och isoleras miRNA-arter först, och sedan kan långa RNA extraheras efteråt, vilket resulterar i två separata fraktioner. Även om Isolate II inte är optimerad för att isolera små RNA som miRVana- eller miRNeasy-satserna var den inte heller överlägsen för målgenuttrycket. Med tanke på den stora skillnaden mellan vissa kit bör forskare välja en mer robust extraktionsmetod.