shRNA – Tillämpningar – Vad är shRNA, hur det fungerar och dess tillämpningar.

Vad är shRNA och hur används det?

Short hairpin RNA-sekvenser (shRNA) kodas vanligen i en DNA-vektor som kan introduceras i celler via plasmidtransfektion eller viral transduktion. shRNA-molekyler kan delas in i två huvudkategorier baserat på deras utformning: enkla stambågar och mikroRNA-anpassade shRNA. Ett shRNA med enkel stamloop transkriberas ofta under kontroll av en RNA Polymeras III (Pol III)-promotor . Transkriptet med 50-70 nukleotider bildar en stam-loop-struktur som består av en 19-29 bp stor region med dubbelsträngat RNA (stammen) som överbryggas av en region med huvudsakligen enkelsträngat RNA (slingan) och ett dinukleotid 3′-överhäng . Det enkla shRNA med stambåge transkriberas i kärnan och går in i RNAi-vägen på samma sätt som ett pre-mikroRNA. Det längre (> 250 nukleotider) mikroRNA-anpassade shRNA:t är en konstruktion som mer liknar ursprungliga pri-mikroRNA-molekyler och består av en shRNA-stamstruktur som kan innehålla mikroRNA-liknande missmatchningar, överbryggad av en slinga och flankerad av 5′- och 3′-endogena mikroRNA-sekvenser . Det mikroRNA-anpassade shRNA:t, liksom den enkla hårnålen med stam och slinga, transkriberas också i kärnan, men tros gå in i RNAi-vägen tidigare på samma sätt som ett endogent pri-mikroRNA.

shRNA-tekniken är DNA-baserad, vilket ger flexibilitet när det gäller vektorns utformning. De flesta vektorbaserade shRNA-system innehåller en selekterbar markör för att möjliggöra eliminering av celler som inte har transfekterats eller transducerats med framgång och underhåll av celler med hållbar gen-nockdown. ShRNA-expressionskassetter kan också införlivas i virala vektorsystem, inklusive retrovirus, adeno-associerat virus, adenovirus och lentivirus, som möjliggör stabil integration i och uttryck från värdgenomet. Dessa virala strategier gör det möjligt att leverera shRNA till cellinjer som är refraktära mot transfektion. Fluorescerande markörer (t.ex. grönt eller rött fluorescerande protein) kan också inkluderas för att spåra celler som uttrycker shRNA. ShRNA:s prestanda påverkas av många faktorer, bl.a. transduktionens eller transfektionens effektivitet, promotorn som driver uttrycket av shRNA:t och epigenetiska modifieringar (som kan leda till att shRNA-uttrycket tystas). Vidare kan det inflytande som var och en av dessa faktorer har på vektorns prestanda skilja sig åt beroende på cellinje eller celltyp . SMARTchoice promotor- och reporteralternativ finns tillgängliga för att hjälpa forskare att välja optimala promotorer för shRNA-uttryck och genavstängning. Slutligen, när dessa shRNA-expressionskassetter kopplas till inducerbara promotorer, som med SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA eller TRIPZ-vektorsystemet, kan forskarna utforma studier för att temporalt och rumsligt modulera genuttrycket .

Videoanimation: RNA-interferens

Hur levereras shRNA till en cell?

Det finns två alternativ för DNA-baserad shRNA-leverans till celler. För plasmider kan typiska transfektionsmetoder användas, t.ex. användning av lipidtransfektionsreagenser eller elektroporation. Lentivirala partiklar är ett utmärkt val för celler som är svåra att transfektera och i situationer där hög effektivitet krävs eller där flera konstruktioner per cell måste levereras. De flesta moderna vektorer har selekterbara markörer som gör det möjligt att selektivt döda celler i kulturen som inte framgångsrikt transfekterades eller transducerades, så att en ren kultur kan utvecklas.

Vad påverkar shRNA-funktionen och -specificiteten?

Optimal genknockdown är ett krav för framgångsrik RNAi med hjälp av shRNA-system. Rationell utformning av shRNA-sekvenser har till stor del baserats på algoritmer som utvecklats med siRNA. Även om vissa siRNA-utformningsregler gäller för shRNA, kommer mer förfinade algoritmer för shRNA-utformning troligen att förbättra målgenens tystnad för shRNA:er i framtiden . För att förutsäga funktionella shRNA-sekvenser väljer Dharmacons SMARTvector™ shRNA-algoritm målsekvenser på grundval av många kriterier, inklusive positionsberoende nukleotidpreferenser, sekundärstruktur och termodynamiska stabilitetsprofiler som är specifika för den SMARTvector mikroRNA-baserade ställningen. Dessutom innehåller SMARTvector-algoritmen flera kriterier för att öka specificiteten.

Som med siRNA kan bioinformatiska metoder tillämpas för att skapa målspecifika shRNA:er och samtidigt minimera risken för off target-effekter. Det är känt att höga koncentrationer av silencing intermediates bidrar till off-target-händelser, men nivån av intermediates är svår att kontrollera när shRNAs uttrycks exogent. Flera publikationer har dokumenterat bevis för att höga nivåer av enkla shRNA-uttryck i form av en stambåge under specifika förhållanden kan mätta den endogena RNAi-vägen och leda till oavsiktliga fenotyper . Andra studier har föreslagit att användningen av ett mikroRNA-anpassat shRNA kan minska den cellulära toxiciteten vid RNAi-experiment in vivo på grund av att dessa scaffolds bearbetas effektivare av både Drosha-DGCR8 och Dicer .

shRNA-tillämpningar

shRNA ger möjlighet till långvarigt tystande av gener. Transduktion av virusbaserat shRNA ger tillgång till celler, t.ex. primära och neuronala celler, som är svåra att transfektera med traditionella katjoniska lipidbaserade strategier. Viralbaserat shRNA har också använts för att utvärdera genernas funktion på helgenomnivå med hjälp av pooler av tystnadskonstruktioner. Pooled eller arrayed screens används nu i stor utsträckning för att utföra screening med hög kapacitet för att identifiera gener som krävs i en rad olika processer, t.ex. cancercellers överlevnad och proliferation , komponenter i tumörundertryckande vägar , modulatorer av däggdjurs cirkadklocka , undertryckare av epitelisk-mesenkymal övergång , värdmediatorer för hiv-1-replikation och regulatorer av cellmigration . Styrkan hos poolad RNAi-screening har också utökats till screening av genfunktion i djurmodeller för att undersöka biologi in vivo.

Vilket shRNA-verktyg är rätt för dina behov?

shRNA Selection Guide

Vi erbjuder ett urval av shRNA-reagens och -bibliotek. Den här snabba urvalsguiden hjälper dig att bestämma det bästa alternativet för dina särskilda behov.

Förtecknade produkter

shRNA – produkter

• Lentivirala vektorbaserade reagenser för RNA-interferens.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Företag smarta, välgrundade val för framgångsrik genavstängning i dina celler av intresse.

SMARTvector Inducible shRNA

• Det mest avancerade och flexibla inducerbara shRNA med en enda vektor som finns tillgängligt för noggrant kontrollerad tystnad av gener.

Poolade lentivirala screeningbibliotek

• Optimerad konstruktion av högkvalitativa pooler, kompletta analysverktyg och validerade protokoll är avgörande för ett lyckat resultat vid screening med poolade lentivirala bibliotek.

Featured Resources

shRNA – Resources

• Hitta produktguider, vanliga frågor och svar med mera.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Teknisk anmärkning som beskriver det experimentella arbetsflödet för SMARTchoice shRNA i suspensionsceller.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Plattformen är ett innovativt system som lämpar sig utmärkt för RNAi-medierade studier.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Experimentella protokoll för knockdown av gener med hjälp av GIPZ lentiviral shRNA.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Ett system för stabilt uttryck av korta interfererande RNA i däggdjursceller. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Stabilt undertryckande av genuttryck genom RNAi i däggdjursceller. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Effektivt uttryck av små interfererande RNA i mänskliga celler. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Andra generationens shRNA-bibliotek som täcker musens och människans genom. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Funktionell analys av olika promotorer i lentivirala vektorer vid olika stadier av in vitro-differentiering av embryonala stamceller från mus. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentivirala vektorer för ökat genuttryck i mänskliga hematopoietiska celler. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-liknande familj av transkriptionsfaktor 9, en differentieringsassocierad transkriptionsfaktor, undertrycker Notch2-signalering och hämmar glioblastom-initierande stamceller. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji samordnar kontrollen av PRC2-enzymaktivitet och målgenupptagningen i pluripotenta celler. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Det cytoplasmatiska FANCA-FANCC-komplexet interagerar och stabiliserar det cytoplasma-dislokaliserade leukemiska nukleofosminproteinet (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Funktionell identifiering av optimerade RNAi-utlösare med hjälp av en massivt parallell sensoranalys. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Dödlighet hos möss på grund av övermättnad av cellulära mikroRNA/kort hårnåls-RNA-vägar. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Artificiellt miRNA mildrar shRNA-medierad toxicitet i hjärnan: implikationer för terapeutisk utveckling av RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC kopplar ihop mikroRNA-biogenes med posttranskriptionell genavstängning. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Högparallell identifiering av viktiga gener i cancerceller. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profilering av viktiga gener i humana bröstceller genom multiplex RNAi-screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Upptäckt av cancerproliferationsgener genom funktionell genomik. Science 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Kandidatbiomarkörer för respons på ett experimentellt cancerläkemedel identifierade genom en storskalig genetisk screening av RNA-interferens. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) En storskalig funktionell RNAi-screening avslöjar en roll för CK2 i däggdjurens cirkadiska klocka. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 är en negativ regulator av epitelial-mesenkymal övergång och metastasering i bröstcancer. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) En genomomfattande short hairpin RNA-screening av Jurkat T-celler för humana proteiner som bidrar till produktiv hiv-1-replikation. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Terapeutisk hämning av miR-208a förbättrar hjärtfunktionen och överlevnaden vid hjärtsvikt. Circulation 124(14):1537-1547.