Positiv funktionell synergi av strukturellt integrerade konstgjorda proteindimerer som sammanställts med hjälp av klickkemi

Klickkemiens gränssnittsytor

Vi antog att det är troligare att områden på ett proteins yta som är kompatibla när det gäller association genererar en integrerad struktur genom att det bildas ömsesidigt kompatibla icke-kovalenta interaktioner. Eftersom proteinerna är monomera är dessa interaktioner i bästa fall svaga och övergående och kommer därför inte att bestå. Vi resonerade att vi behövde en molekylär ”bult” som en del av gränssnittsplatsen för att främja och stabilisera alla nya interaktioner. Det första steget är att identifiera regioner på målproteinerna som har en inneboende potential att interagera. ClusPro 2.040 (cluspro.org) användes för att generera potentiella dimerkonfigurationer. De utgående sfGFP-homodimermodellerna förfinades, analyserades och rangordnades med hjälp av RosettaDock41,42 (kompletterande tabell 1). Den högst rankade konfigurationen visas i fig. 1b (som är den modell som ligger närmast den bestämda strukturen nedan; vide infra), och de fyra nästa rankade konfigurationer visas i kompletterande fig. 1. Även om olika orienteringar av en sfGFP till den andra observerades, avslöjade dockningen att resterna 145-148, 202-207 och 221-224 rutinmässigt bidrog till dimergränssnittet. För att bulta ihop de två proteinerna användes genetiskt kodad bioorthgonal klickkemi (fig. 1a). Fördelen jämfört med t.ex. disulfidlänkar är bl.a. längre sidokedjor för att övervinna potentiella steriska krockar, förbättrad tvärbindningsstabilitet och förmågan att generera ickesymmetriska (olika länkrester på olika monomerer) och heterodimerer på ett designat 1-till-1-manér (vide infra).

Med utgångspunkt i dimermodellerna valdes tre rester ut för att ersättas med de två klickkompatibla ncAA:erna SCO43 (strained alkyne) och azF (azid)44,45 (fig. 1a). H148 och Q204 valdes utifrån deras placering vid det förmodade dimergränssnittet (fig. 1b och kompletterande fig. 1). Båda resterna är kända för att lätt modifieras med små molekylära cyklooktynaddukter vid azF-inkorporering34,46 och ligger nära det funktionella centret, sfGFP-kromoforen (CRO) (fig. 1b). Analys av gelrörlighetsförskjutning visade att dimeriseringen lyckades (fig. 1c, d); detta bekräftades genom masspektrometrianalys (kompletterande fig. 2). Residue 132 förutspåddes inte vara vid dimergränssnittet (Fig. 1b och Supplementary 1), men är känd för att vara kompatibel med en rad ansträngda alkanaddukter, från färgämnen46 till kolnanorör35 och enkelsträngat DNA36. Den fungerar därför som ett bra test av vår förmåga att förutsäga protein-proteingränssnitt och Click-reaktionskompatibilitet. Trots att rest 132 är ytexponerad observerades ingen dimerprodukt när man använde sfGFP132azF med SCO-innehållande protein (kompletterande figur 3), vilket visar på vikten av kompatibilitet med ytgränssnitt och användbarheten av in silico-analys för att hjälpa till att identifiera platser som är kompatibla med klickkemi. Antingen steriska krockar och/eller protein-proteininteraktioner som kvarstår längre vid andra regioner kan hindra kovalent tvärbindning vid rest 132.

Positiv funktionell omkoppling vid bildandet av sfGFP148x2 dimer

H148 bildar en H-bindning med CRO (Fig. 1b) och spelar en viktig roll i protonshuttling som reglerar populationen av den neutrala A (λmax ~ 400 nm, CRO A) och den anjoniska B-formen (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 som finns i grundtillståndet. B-formen dominerar i sfGFP, men när man införlivar azF i stället för H148 (sfGFP148azF) avlägsnas H-bindningen, vilket leder till att A-tillståndet nu dominerar33,34 (fig. 2a och tabell 1). Inkorporering av SCO vid rest 148 (sfGFP148SCO) framkallar en liknande effekt, där CRO A dominerar men med en mindre rödförskjutning (λmax 492 nm) i den mindre CRO B-formen (fig. 2a och tabell 1).

Dimerisering av sfGFP148azF och sfGFP148SCO ger två signifikanta positiva effekter: (i) fluorescens vid ~490 nm på grund av främjande av CRO B-formen; (ii) kraftigt förbättrad ljusstyrka genom ökad molär absorbanskoefficient vid 490 nm (fig. 2a och tabell 1). Den viktigaste excitationstoppen är rödförskjuten vid dimerisering (λmax 492 nm) jämfört med sfGFPWT (λmax 485 nm) (kompletterande tabell 3). Absorptionsförhållandet 490:400 nm skiftar med en storleksordning från ~0,5 för monomerer till ~5 för dimer, där CRO B-formen dominerar dimerabsorptionsspektrumet (fig. 2a) trots den uppenbara avsaknaden av en art som kan ersätta H148-imidazolgruppens roll. Tidigare exempel på modifiering av sfGFP148azF med addukter av små molekyler eller fotoaktivering resulterar i bästa fall i en partiell omvandling till CRO B-form33,34. Det 10-faldiga bytet i absorbans speglas i fluorescensemission; excitation vid 490 nm resulterar i ~20-faldigt högre emission än någon av monomerna (fig. 2a). Dessutom uppvisar dimern en förbättrad funktion även jämfört med den ursprungliga superfoldern sfGFPWT (fig. 2b och tabell 1). Den molära absorbansen och ljusstyrkan ökade ~320 % för sfGFP148x2 (~160 % per CRO) (Fig. 2b) högre än vad som förväntas för en enkel additiv ökning om monomerenheterna agerar oberoende av varandra.

För att undersöka betydelsen av den biorthogonala länken konstruerade vi en klassisk disulfidbaserad länk genom att mutera H148 till cystein. Varianterna sfGFPH148C dimeriserades, men endast i närvaro av Cu2+ (kompletterande figur 4). De spektrala egenskaperna tydde på att dimern var mindre fluorescerande jämfört med sfGFP148x2 och sfGFPWT (kompletterande figur 4). Monomeren sfGFPH148C uppvisade den förväntade växlingen från CRO B till CRO A. Även om en växling från CRO A till CRO B observerades vid dimerisering av sfGFPH148C hade dimeren en lägre absorbans per CRO-molär absorbans än sfGFPWT och betydligt mindre än sfGFP148x2; en betydande population av A-tillståndet observerades fortfarande. Fluorescensemission vid excitation vid 490 nm för dimeriska sfGFPH148C var ungefär hälften så stor som för sfGFPWT. Således genererade den biorthogonala metoden en bättre presterande dimerisk art än klassisk disulfidbindningslänkning.

Molekylär grund för funktionell växling i sfGFP148x2

Kristallstrukturen för sfGFP148x2 (se tilläggstabell 2 för statistik) avslöjar att monomererna bildar ett omfattande dimergränssnitt med interaktioner med lång räckvidd som länkar samman de två CRO-centren. Monomerenheterna i sfGFP148x2 arrangerar sig i ett kvasisymmetriskt arrangemang med huvud mot svans som är förskjutet med ~45° i förhållande till varandra (fig. 3a). Det antiparallella monomerarrangemanget sida vid sida ligger närmast den högst rankade modellen (kompletterande figur 1 och kompletterande tabell 1). Elektrontätheten hos den nya triazolkorslänken är tydligt definierad (fig. 3b) och bildar den långsträckta anti-1,4-triazol-länken som är delvis begravd och intimt förknippad med båda monomerenheterna så att den utgör en integrerad del av dimergränssnittet (fig. 3c). CRO:erna ligger 15 Å ifrån varandra och pekar mot varandra (fig. 3a).

Gränssnittet har liknande egenskaper som naturliga dimerer48. Gränssnittets begravda yta är ~1300 Å2, där i allmänhet samma rester från varje monomer bidrar (fig. 3c, d). H-bindningar spelar en viktig roll med rester E142, N146, S147, N149 och N170 från båda monomerer som bidrar till åtta H-bindningar mellan underenheterna (fig. 3b). Strukturen visar att naturliga dimergränssnitt kan efterliknas och stabiliseras genom användning av Click-länkade monomerer, som enligt den ursprungliga modelleringen var genomförbara, men som förmodligen var för svaga eller övergående för att bestå utan den inbäddade länken. Det kan alltså vara så att vårt tillvägagångssätt skulle kunna användas för att stabilisera mer allmänt övergående svaga protein-proteininteraktioner så att definierade gränssnitt bildas.

Dimerisering inducerar en serie konformationsförändringar för att bilda ett interaktionsnätverk med lång räckvidd som ligger till grund för den mekanism genom vilken sfGFP slås på och ljusstyrkan förstärks. Strukturen sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 visar att 148azF intar en liknande position som H148 i sfGFPWT men inte kan från den kritiska H-bindningen till CRO fenol OH-gruppen som främjar bildandet av CRO B-tillståndet. Vid dimerisering leder modifiering av 148azF genom bildande av triazol-länken med 148SCO i den motsvarande monomeren till en förändring av både dess ryggrad och sidokedjans position, vilket ger upphov till ett hål som nu kan upptas av en vattenmolekyl i dimern (W1azF i fig. 4a). Vattnet kan H-binda sig till CROazF och 148azF:s karbonyl i ryggraden (fig. 4). Ett motsvarande vatten finns i monomerenheten sfGFP148SCO (W1SCO) som bildar liknande interaktioner. Dessa strukturerade vattenmolekyler har potential att ersätta den H-bindningsinteraktion som går förlorad när H148 avlägsnas, vilket aktiverar dimern genom att främja bildandet av CRO B i grundtillståndet. Vattenmolekylerna är också begravda vid dimergränssnittet, vilket innebär att det dynamiska utbytet med bulklösningsmedlet kommer att vara mycket mindre. Dessutom är de två CRO:erna nu sammanlänkade genom ett utvidgat, huvudsakligen vattennätverk som sträcker sig över dimergränssnittet (fig. 4b, c). En analys av tunnelsammansättningen visade att tre vattenmolekyler i varje enhet (W1azF/SCO, W2azF/SCO och W3azF/SCO) är symmetriska. W4 i kombination med F145SCO:s ryggrad bildar en bro över dimergränssnittet för att länka samman de två vattennätverken. Dimerisering genererar således ett utvidgat, intermonomer vattenrikt H-bond-nätverk och främjar på så sätt en övergång från A-stat CRO till B-form.

Fluorescensanalys av sfGFP148x2

Total internreflektionsfluorescensmikroskopi (TIRF) användes för att undersöka det fluorescerande beteendet hos sfGFP148x2-dimerer på singelmolekylnivå. Tidsförloppet för fluorescensintensiteten hos enskilda sfGFP148x2-dimerer visade på en rad olika intensitetstillstånd, där fluorescens vid ~80-100 räkningar dominerade och uppvisade en längre livslängd än subpopulationen av tillstånd med högre intensitet, där dessa kännetecknades av kortvariga utflykter till en rad olika intensiteter från ~100 till 300 räkningar (fig. 2c). Fluorescensspåren visar också på långvarig fotostabilitet med långa perioder till fotoblekning (fig. 2c och kompletterande fig. 5). Som jämförelse kan nämnas att sfGFPWT fotoblekas snabbare, med fluorescensspår som visar ett enda intensitetstillstånd där on-tillstånden i allmänhet varar i kortare perioder (kompletterande figur 6). Dessutom konstaterades monomerer sfGFPWT ibland existera i ett initialt mörkt, icke-fluorescerande tillstånd, innan fluorescens och efterföljande fotoblekning inleds (kompletterande fig. 6). Extraktion av den genomsnittliga sammanhängande fluorescenstiden före fotoblekning och upptagande av övergående icke-fluorescerande tillstånd (blinkning) visar att sfGFP148x2 uppvisar längre perioder av kontinuerlig fluorescens (medelvärde 0,9 s), jämfört med sfGFPWT (0,65 s). Med tanke på likheten i den uppmätta fluorescensintensiteten för enskilda molekyler bidrar de ökade ON-tiderna och fotoblekningslivslängden sannolikt till den ökade fluorescens som observeras i steady state-ensemble-mätningar av sfGFP148x2 (fig. 2a).

I ett försök att rationalisera de olika fluorescenstillstånden som observeras i dimer-spåren genererades ett histogram av alla uppmätta intensiteter (fig. 2c). Till skillnad från sfGFPWT (kompletterande figur 6) som visar en enda log-normal fördelning49 , gynnade sfGFP148x2 en anpassning med två komponenter50 (fig. 2c). Den uppmätta intensitetsfördelningen visar en dominerande topp med lägre intensitet (~90 counts) och en delvis överlappande topp med högre intensitet, som en följd av de korta utflykterna till tillstånd med högre intensitet som observerats i fluorescensspåren för enskilda molekyler. Medan en bimodal intensitetsfördelning normalt kan förväntas i en dimer som består av två samlokaliserade oberoende aktiva fluoroforer, där varje fluorofor fotoblekas i tur och ordning, stämmer inte tidsspåren för intensitetsförloppet för enstaka molekyler överens med denna modell och visar en brist på två väldefinierade tillstånd. Det enkla on/off-tillståndsbeteendet hos sfGFPWT observeras sällan i dimer-spåren, som i sig inte uppvisar den förväntade addukten av två monomera spår, utan i stället uppvisar ett mer komplext beteende.

Förbättrad funktion vid bildandet av sfGFP204x2 dimer

För att utforska hur olika kopplingsställen kan framkalla funktionella effekter undersökte vi den alternativa dimern sfGFP204x2 (fig. 5a) som konstruerades ovan (fig. 1d). Vi fann att dimerisering förbättrade de spektrala egenskaperna jämfört med enkel tillsats av de monomera eller sfGFPWT-proteinerna, vilket återigen belyser de synergistiska fördelarna med dimerisering. Inkorporering av antingen azF eller SCO vid rest 204 hade liten effekt på de spektrala egenskaperna jämfört med sfGFPWT 46 (fig. 5b och tabell 1). B CRO-formen dominerade i de monomera formerna; både den molära absorbansen och emissionsintensiteten liknade varandra och sfGFPWT. Fluorescensemissionen för sfGFP204SCO var något reducerad (80 % av sfGFPWT; tabell 1). Vid bildandet av dimer sfGFP204x2 (se fig. 1d och kompletterande fig. 2 för bevis) visade spektralanalysen en funktionell förbättring när det gäller de centrala spektrala parametrarna: molär absorbanskoefficient (ε) och fluorescensemission (fig. 5b och tabell 1). Vid dimerisering ökade ε med upp till 400 % jämfört med utgångsmonomererna till 160 000 M-1 cm-1. Detta motsvarar en genomsnittlig per CRO molär absorbans på 80 000 M-1 cm-1, vilket nästan fördubblar ljusstyrkan jämfört med utgångsmonomererna och 31 000 M-1 cm-1 högre jämfört med sfGFPWT. I linje med den ökade kapaciteten att absorbera ljus ökade också fluorescensutsläppet; det normaliserade utsläppet per CRO var 180 % högre än för monomeren sfGFP204azF. Med hjälp av Strickler-Berg51 -beräkningen (webbplats huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) sjunker fluorescenslivslängden från 3,2 ns för sfGFPWT till 0,92 ns för sfGFP204x2. Liksom för sfGFP148x2 har den dimeriska strukturen hos sfGFP204x2 således en ökad sannolikhet för elektronisk excitering och fluorescensutsändning jämfört med de monomeriska formerna (se kompletterande figur 8 för spektraljämförelse av dimerer). Detta är desto mer imponerande för båda de dimeriska formerna eftersom sfGFPWT är ett riktmärke för grönt fluorescerande proteins prestanda.

Symmetrins betydelse för synergieffekter

Naturliga proteinhomodimerer är generellt sett symmetriska1,52 och en sådan symmetri efterliknades i vår konstgjorda dimer genom en gemensam tvärbindningsrest. Vi undersökte betydelsen av en gemensam tvärbindningsrest (som en imitation av strukturell symmetri) för funktionell synergi. Fördelen med biorthogonal kemi är att de ömsesidigt kompatibla reaktionshandtagen gör det möjligt att konstruera definierade par (dvs. 148 + 204 = 148-204 och inte 148-148 eller 204-204), vilket förhindrar att oönskade produkter bildas som blir svåra att separera.

Dimerer genererades som kopplade ihop rest 148 och 204 i de två tillgängliga kombinationerna (148SCO+204azF och 148azF+204SOC). Fluorescens i stationärt tillstånd visade att i båda dimerformerna var de protonerade och deprotonerade formerna av CRO tydligt närvarande (fig. 6a, b). Den 148azF-204SCO länkade dimeren uppvisade en förändring i de relativa populationerna av A- och B-formerna, med en betydande ökning av den molära absorbanskoefficienten vid 490 nm (Fig. 6a); den var nästan dubbelt så stor som den ursprungliga sfGFP204SCO och ~30 % högre än den som förutspåddes genom enkel addition av monomerspektra. Den relativa höjden av 400 nm-toppen förblir likartad i både sfGFP148azF och den 148azF-204SCO-länkade dimeren, vilket tyder på att populationen av den deprotonerade formen är likartad i dimeren som i den ursprungliga monomeren. Dimerisering via kombinationen 148SCO-204azF förändrade de relativa populationerna av de protonerade och deprotonerade formerna, men minskningen av absorbanstoppen vid 400 nm motsvarades inte av en samtidig ökning av toppen vid 490 nm (fig. 6b). I själva verket var dimeriseringen till stor del skadlig eftersom båda de större absorbanstopparna hade en lägre molär absorbanskoefficient än monomerernas enkla additionsspektra (fig. 6b). Det är tydligt att de asymmetriskt länkade dimererna är mindre fluorescerande och innehåller en betydande blandad population av de två CRO-tillstånden jämfört med de symmetriskt länkade dimererna, så i detta fall har symmetrin viktiga funktionella implikationer.

Heterodimerer och funktionell integration

Heterodimerer, där en dimer består av två olika proteiner, är ett vanligt observerat alternativt dimeriseringstillstånd1,2. Det gör det också möjligt för oss att utforma nya komplex där funktionellt skilda proteiner kan kopplas samman. Fördelen med bioorthogonal koppling är möjligheten att generera definierade (hetero)dimerer av en enda art som består av två olika proteinenheter (dvs. A + B = A-B inte A-A, B-B, A-B blandning som kan vara svår att separera). Det gula fluorescerande proteinet Venus29 valdes som partnerprotein till sfGFP, med tanke på den spektrala överlappningen mellan de två (kompletterande figur 9). Sekvensskillnader visas i kompletterande figur 10.

SfGFP148SCO kombinerades med motsvarande azF-innehållande Venus (Venus148azF) för att generera GFVen148 (se kompletterande figur 11 för bevis). Nya spektrala egenskaper framträder som tyder på att ett integrerat system har genererats. Bildandet av GFVen148 genererar en dimer som visar förbättrad ljusstyrka jämfört med antingen sfGFP148SCO eller Venus148azF (fig. 7a och kompletterande tabell 3). Intressant nog har dimern spektrala egenskaper som ligger mellan individuella monomerer utan någon betydande toppbreddning (fig. 7a, b och kompletterande fig. 12a), vilket tyder på att de två CRO-centren har blivit funktionellt integrerade när det gäller fluorescensutsläpp. Den viktigaste λmax är 505 nm, vilket ligger mellan sfGFP (492 nm) och Venus (517 nm). ε-ekvivalenten för B CRO-formen (490-510 nm-regionen) ökar betydligt (~4-5 gånger), högre än monomerernas enkla additiva spektrum, medan A CRO-populationen minskar men fortfarande observeras (fig. 7a). Detta motsvaras av en ~4-faldig ökning av emissionsintensiteten vid excitation vid 505 nm (fig. 7b). En enda emissionstopp observeras som också ligger mellan de två monomererna, oavsett excitationsvåglängden (λEM vid 517 nm; fig. 7b, c); en enda snarare än en dubbel eller breddad topp observerades vid excitation vid 490 nm (som kan excitera båda CRO:erna), vilket tyder på att det är en enda art som emitterar. Ett additivt spektrum av individuella monomerspektra som simulerar två oberoende verksamma proteiner stöder idén om en ny integrerad funktion eftersom det är bredare och rödförskjutet jämfört med den uppmätta GFVen148x2-emissionsprofilen (kompletterande fig. 12b). Emission vid excitation vid 400 nm mättes också eftersom Venus148azF har liten absorbans vid denna våglängd jämfört med GFVen148. Emissionsintensiteten var 30 gånger högre för GFVen148 jämfört med monomerisk Venus148azF med emission som toppar vid 517 nm (fig. 7c och kompletterande fig. 12c). I stället för att uppvisa klassisk FRET, som man skulle kunna förvänta sig (se ovan), verkar GFVen148 agera som en enda enhet när det gäller fluorescensutsläpp. Detta skulle kunna tyda på att två CRO:er nu huvudsakligen agerar som en art där de strukturella aspekter som observerats för sfGFP148x2 (t.ex. vattennätverket) spelar en roll. Förekomsten av ett betydande neutralt A-tillstånd i CRO tyder på att de två monomera enheterna inte är helt synkroniserade. Detta förnekar dock inte den tydliga inverkan som dimerisering kan ha på genereringen av nya spektrala egenskaper såsom de som ses i GFVen148.

Som för sfGFP hade inkorporering av azF i stället för Q204 (benämnt Venus204azF) liten effekt på Venus spektrala egenskaper (kompletterande tabell 3). Kovalent koppling via 204 SPAAC (vilket gör GFVen204) genererade framgångsrikt en dimer (kompletterande figur 11). GFVen204 kombinerade de spektrala egenskaperna hos båda monomererna och genererade en art med λMax vid både 490 och 514 nm (förhållandet 1:1,2) (fig. 7e, f och kompletterande tabell 3). Venus204 absorberar också vid 490 nm men i förhållandet 1:2,7 till 514 nm. Bildandet av dimerer ökade återigen den molära absorbansen över den för de enskilda monomererna; särskilt ε ökade med ~26 000 M-1 cm-1 (~27 %) för den Venus-associerade λmax (514 nm) där det finns ett litet bidrag för sfGFP. För att undersöka kommunikationen mellan monomererna övervakades fluorescensemission vid excitation vid fyra separata våglängder: 400 nm (endast sfGFP); 450 nm (sfGFP, mindre Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venus axel); 510 (Venus, mindre sfGFP). Vid alla excitationsvåglängder var den enda tydliga emissionstoppen vid 528 nm (fig. 7b), vilket motsvarar Venus som indikerar kommunikation genom Förster-resonansenergiöverföring (FRET). En emissionstopp som korrelerar med sfGFP204SCO (~510 nm) observerades inte ens vid excitation vid de lägre våglängder som är specifika för sfGFP. Inte heller observerades den intermediära emissionstopp som är karakteristisk för GFVen148, vilket understryker de nya egenskaperna hos 148-heterodimern. Den mest signifikanta skillnaden observerades vid excitation vid 400 nm där det finns en 14-faldig ökning av emissionsintensiteten vid 528 nm för GFVen204 jämfört med Venus204azF (fig. 7f, inset). Den beräknade relativa FRET-effektiviteten efter spektral nedbrytning var cirka 90 %. Således kommunicerar de två funktionella centren genom energiöverföring (fig. 7g) på ett mycket effektivt sätt.