Reglering av motilitet av det centrala paret
Motilitetsförändringar som svar på externa stimuli kan ske på två olika sätt. Stimulansen kan ändra frekvensen av slumpmässig omorientering, vilket sker i bakterier, så att motilitet i en gynnsam riktning belönas, eller så kan stimulansen direkt reglera motiliteten så att organismen vrider sig i en definierad riktning i förhållande till stimulansen (mot stimulansen för positiva taxor, bort för negativa taxor). En sådan taktisk vändning kräver lokaliserade receptorer som kan fungera som en antenn och en motilitetsapparat som kan styras riktningsmässigt (Foster och Smyth, 1980). En enkel typ av reglering av typen stopp-reorientering-start kräver ingen sofistikerad reglering av motiliteten. I flageller kräver riktningsreglering samordnade förändringar i vågform och slagfrekvens och därmed en mer sofistikerad regleringsapparat. Det centrala paret-radiella ekarsystemet fyller den rollen i 9+2 cilier och flageller, vilket demonstreras mest elegant i Chlamydomonas (fig. 1D). Denna encelliga biflagellatalg reagerar på fototaktisk stimulans genom att ändra den relativa vågformen, slaghastigheten och slagfrekvensen hos sina två flageller (Witman, 1993). Tillgängliga bevis tyder på att fototaxis inbegriper en signaltransduktionsväg från den centrala apparaten, genom radiella ekrar, till ett dubbelassocierat regleringskomplex, som sedan ändrar mönstret för dyneinaktivitet och därmed för bildandet och spridningen av krökar genom förändringar i dyneinassocierade proteinkinaser och fosfataser (Porter och Sale, 2000; Smith och Yang, 2004).
Och även om det kan ha funnits mer än ett möjligt sätt att bilda en asymmetrisk centralapparat, kan en som bygger på en minimal ställning av två mikrotubuli ha varit den första som utvecklats och skulle kräva en minimal förändring av protocilium, främst tillägget av en ny plats för initiering av sammansättning i övergångszonen tillsammans med en struktur (radial spoke) för att överföra signaler från centralapparaten till dubbeltassocierade dyneiner. Vi föreställer oss att radiella ekrar har utvecklats från dyneinreglering i ark av dubbletter, där de vid sina baser interagerade med ett dubblettassocierat dyneinregleringskomplex och vid sina spetsar med mikrotubuliassocierade proteiner på en annan rad av dubbletter eller på ett kortikalt singulärt mikrotubulcytoskelett. Med tanke på att det är troligt att flagellära dyneiner utvecklats från cytoplasmatiska dyneiner verkar det anmärkningsvärt att inga gemensamma regleringsmekanismer är kända för dessa två dyneinfamiljer. Detta kan dock återspegla vår nuvarande kunskapsbrist snarare än en avsaknad av bevarade mekanismer. En nyligen genomförd molekylär analys av ett protein i Chlamydomonas dyneinregleringskomplex avslöjade en primärstruktur som har likheter med cytoplasmatiska proteiner, men ett släktskap med cytoplasmatiskt dynein har inte fastställts (Rupp och Porter, 2003).
Att räkna ut specifika interaktionsmönster mellan projektioner från det centrala parets mikrotubuli och radiella ekrar som framkallar specifika förändringar av dyneinaktiviteten är fortfarande en stor gåta. Nya resultat från vårt labb, inklusive analysen av normal centralparstruktur, karakterisering av mutanter med defekt centralparsammansättning och bestämning av centralparsorientering under böjförökning, begränsar modellerna för hur CP reglerar dynein. Här försöker vi sammanställa en hypotes om reglering av det centrala paret som är förenlig med dessa resultat.
Precisa elektronmikroskopiska tunnsnittsundersökningar av axonem från Chlamydomonas och Tetrahymena, tillsammans med negativa färgpreparat av centrala parkomplex från Tetrahymenas cilier (Chasey, 1969) och flageller från råttspermier (Olson och Linck, 1977) avslöjade den asymmetriska strukturen hos centrala parkomplex och definierade CP-mikrotubulerna med längre projektioner i tvärsnittet och 32 nm upprepningsperiodicitet som C1, medan den andra (C2) har kortare projektioner med endast 16 nm upprepningsperiodicitet. Genom att jämföra tvärgående och längsgående tunna snitt av centrala parkomplex av vildtyp med centrala parkomplex från assembleringsmutanter pf6 och cpc1 bestämde jag de strukturella relationerna och upprepningsperioderna för de flesta C1- och C2-associerade projektioner i Chlamydomonas. Ytvyer som tillhandahålls av stereobilder av snabbfrysta, djupt etsade preparat bekräftade och utvidgade dessa slutsatser och resulterade i en ganska komplett tredimensionell rekonstruktion av det centrala paret (Mitchell, 2003a). Dessa studier ger en modell av potentiella platser för växelverkan mellan ekrar på det centrala paret, och visar i synnerhet diskontinuiteter i CP:s annars cylindriska yta längs mikrotubuliytorna som vetter mot intilliggande ekrarhuvuden. Man betonar också den övergripande asymmetrin hos CP-komplexet, vilket tyder på unika ekinteraktioner vid olika radiella positioner runt CP-cylindern. Kloning av generna pf6 (Rupp et al., 2001) och cpc1 (Mitchell och Sale, 1999; Zhang och Mitchell, 2004) och identifiering av deras genprodukter identifierade inga uppenbara kandidater för proteiner som interagerar med radiella ekrar, men ett kinesinliknande protein (Klp1) på C2-mikrotubuli (Bernstein et al., 1994) är en attraktiv kandidat för ett ek-bindande protein. Vi har nyligen visat att flageller i Klp1 knockdown-celler slår med dramatiskt minskad frekvens (Mitchell och Yokoyama, 2003).
EM-studier visar att CP bibehåller en fast orientering i förhållande till cellkroppen och de yttre dubbletterna i vissa organismer, medan CP i andra organismer har en variabel orientering. Fylogenetiskt sett verkar en fast orientering vara en härledd förenkling i organeller som har ett fast böjningsplan, t.ex. ctenophore comb plate cilia (Tamm och Tamm, 1981) och många metazoers spermatozoer (Sale, 1986). I extrema exempel är C1- och C2-mikrotubulerna fästade vid dubbletterna 8 respektive 3 genom permanenta länkar (antingen modifierade ekrar eller tillbehörsstrukturer). I motsatt extremitet finns cilier och flageller hos encelliga organismer som förlitar sig på snabba förändringar i vågform, slagfrekvens och effektiv slagriktning för att reagera på signaler från omgivningen. CP i dessa organeller är vridna, så att de inte upprätthåller en fast orientering från bas till spets inom de omgivande 9 dubbletterna. Dessutom roterar dessa vridna CP under böjutbredningen (Omoto et al., 1999). Vi har nyligen visat att Chlamydomonas CP är orienterad parallellt med krökplanet inom varje krök (Fig. 1D) och vrider sig 180° mellan på varandra följande huvudkrökar och omvända krökar, och att C1-mikrotubuli alltid är närmast dubbletterna på utsidan av varje krök (Mitchell, 2003b). Denna konstanta orientering av CP i förhållande till en krökning i Chlamydomonas gör det möjligt för en uppsättning CP-projektioner att interagera med radiella ekrar som är fästa vid dubbletter med aktiva dyneiner, medan en annan uppsättning CP-projektioner interagerar med radiella ekrar på dubbletter med inaktiva dyneiner.
Men även om slaghöljet är nästan plant i Chlamydomonas, och riktningen för huvudkrökar inte förändras dramatiskt från ett konstant plan, så är detta inte sant i andra organismer. Om CP-orienteringen också följer böjningsorienteringen i dessa andra organismer, vilket jag föreslår, är CP alltid positionerad för att ge flexibel motilitetskontroll. Våra senaste resultat visar att CP-orienteringen passivt anpassar sig till böjningarna när de bildas vid basen av en flagell i Chlamydomonas, och att denna böjningsberoende orientering sedan förflyttas när varje böjning fortplantar sig från basen till spetsen. En analogi från ingenjörsvetenskapen är en snäckväxel, där rotationen av snäckan (det centrala paret) är kopplad till den vinkelräta rörelsen (böjutbredning) hos de inbördes sammanväxande kuggarna i en tandväxel (axonemala böjningar). Riktningen för en huvudkrökning kan därför inte bestämmas av det centrala parets orientering, som passivt anpassar sig till krökarna, utan måste regleras på den yttre dubblettens nivå, genom initieringsmönster vid flagellbasen. Reglerande signaler från CP kan sedan bestämma form och slagfrekvens genom direkt modulering av dyneinaktivitetsmönster inom utvecklande och fortskridande krökar. Denna hypotes stämmer överens med resultaten från vibrerande omorientering av slagplanet i sjöborreaxonem (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Om det nya böjplanet som induceras av vibrationer tvingar fram en ny orientering av det centrala paret, skulle systemets avslappning efter avlägsnande av den påtvingade vibrationen från dessa celler kräva en gradvis rotation av det centrala paret tillbaka till sitt viloläge. Tyvärr erhölls ingen information om den faktiska CP-orienteringen i dessa experiment. Denna hypotes stämmer också överens med det mönster för glidning av dubbletter som observerats i proteasbehandlade axonem från Chlamydomonas, där dubblettens glidningsmönster upprätthåller ett konstant förhållande till centralparets orientering (Wargo och Smith, 2003; Wargo et al…, 2004), och med studier av dyneinaktivitet i störda axonem från Chlamydomonas (Smith, 2002) och sjöborrar (Yoshimura och Shingyoji, 1999; Nakano et al., 2003), som visar kalcium- och centralparsberoende aktivitetsmodulering.
Vilket prediktivt värde har dessa spekulationer om utvecklingen av cilier och flageller? För det första antar vi att utvecklingen av flagellars ytmotilitet är primitiv och sannolikt kommer att påträffas på bred front, även i ciliäravledningar som inte slår. Det är uppenbart att IFT är en viktig och universell motilitet för montering av både rörliga och icke-rörliga organeller, så kopplingen av detta maskineri till extracellulär rörelse kan vara lika utbredd. För det andra är också sekvenseringen av receptorer på ciliarmembranen primitiv, och sannolikt ett viktigt selektivt tryck för den fortsatta existensen av icke-motila primära cilier, liksom mer höggradigt modifierade cilier i sinnesorganen. Eftersom ciliärderivat tillhandahåller viktiga funktioner i sensoriska neuroner hos många organismer behövs det bara ett litet språng i fantasin för att föreslå att protocilium också utgjorde den uråldriga plattformen för alla sensoriska processer, och att ytterligare egenskaper hos denna organell kan vara gemensamma i sensoriska transduktionskaskader. För det tredje är orienteringen av centrosomen som en indikator på cellpolaritet och migrationsriktning för rörliga celler också mycket primitiv. Om så är fallet tyder protociliumets betydelse som en tidig bestämningsfaktor för cellpolaritet och riktad migration på att fler kopplingar bör sökas mellan mekanismer som bestämmer cellpolaritet och mekanismer som orienterar centrosomer/centrioler tillsammans med den cytoplasmatiska mikrotubuliuppställningen. Slutligen måste regleringen av cilier och flageller genom det centrala paret också ha utvecklats mycket tidigt i den eukaryotiska evolutionen, före strålningen av alla existerande eukaryotiska fyler. Även om det otvivelaktigt finns skillnader i den detaljerade reglering som krävs av dessa organeller i olika organismer och celltyper, bör vi förvänta oss att hitta många universella drag i det sätt på vilket interaktioner mellan centralparet och radialekarna reglerar dyneinaktiviteten, och vi kan fortfarande hitta gemensamma teman i regleringen av axonemala och cytoplasmatiska dyneinmotorer.