En allmän blottingprocedur börjar med extraktion av totalt RNA från ett homogeniserat vävnadsprov eller från celler. Eukaryotiskt mRNA kan sedan isoleras genom användning av oligo (dT) cellulosakromatografi för att isolera endast de RNA som har en poly(A)-svans. RNA-proverna separeras sedan genom gelelektrofores. Eftersom gelerna är bräckliga och proberna inte kan tränga in i matrisen, överförs RNA-proverna, som nu är separerade efter storlek, till ett nylonmembran genom ett kapillär- eller vakuumblottsystem.
Kapillär blotting systemuppsättning för överföring av RNA från en elektroforesegel till ett blottingmembran.
Ett nylonmembran med positiv laddning är det mest effektiva för användning vid nordlig blotting, eftersom de negativt laddade nukleinsyrorna har en hög affinitet för dem. Den överföringsbuffert som används för blotting innehåller vanligen formamid eftersom den sänker glödgningstemperaturen för samspelet mellan sond och RNA, vilket eliminerar behovet av höga temperaturer, som skulle kunna orsaka RNA-nedbrytning. När RNA har överförts till membranet immobiliseras det genom kovalent bindning till membranet med hjälp av UV-ljus eller värme. När en sond har märkts hybridiseras den till RNA:t på membranet. Experimentella förhållanden som kan påverka hybridiseringens effektivitet och specificitet är bland annat jonstyrka, viskositet, duplexlängd, mismatchade baspar och bassammansättning. Membranet tvättas för att säkerställa att sonden har bundits specifikt och för att förhindra att bakgrundssignaler uppstår. Hybridsignalerna detekteras sedan med hjälp av röntgenfilm och kan kvantifieras genom densitometri. För att skapa kontroller för jämförelse i ett northern blot kan prover som inte visar den aktuella genprodukten användas efter bestämning med mikroarrayer eller RT-PCR.
GelsEdit
RNA körs på en agarosgel av formaldehyd för att framhäva 28S- (övre bandet) och 18S- (nedre bandet) ribosomala underenheter.
RNA-proverna separeras oftast på agarosgeler som innehåller formaldehyd som denatureringsmedel för RNA för att begränsa sekundärstrukturen. Gelerna kan färgas med etidiumbromid (EtBr) och ses under UV-ljus för att observera kvaliteten och kvantiteten av RNA före blotting. Polyakrylamidgelelektrofores med urea kan också användas för separation av RNA, men det används oftast för fragmenterat RNA eller mikroRNA. En RNA-stege körs ofta tillsammans med proverna på en elektroforesegel för att observera storleken på de fragment som erhålls, men i prover av totalt RNA kan de ribosomala underenheterna fungera som storleksmarkörer. Eftersom den stora ribosomala underenheten är 28S (ca 5 kb) och den lilla ribosomala underenheten är 18S (ca 2 kb) visas två framträdande band på gelen, varav det större är nästan dubbelt så starkt som det mindre.
ProbesEdit
Probes för northern blotting består av nukleinsyror med en komplementär sekvens till hela eller delar av det intressanta RNA:t. De kan vara DNA, RNA eller oligonukleotider med minst 25 komplementära baser till målsekvensen. RNA-sonder (riboprober) som transkriberas in vitro kan tåla strängare tvättsteg, vilket förhindrar en del av bakgrundsbruset. Vanligtvis skapas cDNA med märkta primörer för den aktuella RNA-sekvensen för att fungera som sond i nordblottningen. Proberna måste märkas antingen med radioaktiva isotoper (32P) eller med kemiluminiscens där alkaliskt fosfatas eller pepparrotsperoxidas (HRP) bryter ner kemiluminiscenta substrat som ger en detekterbar ljusemission. Den kemiluminiscenta märkningen kan ske på två sätt: antingen är sonden fäst vid enzymet eller så är sonden märkt med en ligand (t.ex. biotin) för vilken liganden (t.ex. avidin eller streptavidin) är fäst vid enzymet (t.ex. HRP). Röntgenfilm kan detektera både de radioaktiva och kemiluminiscenta signalerna och många forskare föredrar de kemiluminiscenta signalerna eftersom de är snabbare, känsligare och minskar de hälsorisker som är förknippade med radioaktiva märken. Samma membran kan undersökas upp till fem gånger utan att mål-RNA:et förloras nämnvärt.