26.3.1.1.1 T1R-receptorerna: Transduktion av söta och umamis smakkvaliteter
De första metabotropa receptorerna som identifierades i gustation var två medlemmar av T1R-familjen, T1R1 och T1R2 (ursprungligen benämnda TR1 och TR2),41 och de upptäcktes med hjälp av subtraktiva och differentiella screeningtekniker för enskilda celler. Dessa receptorer uppvisar cirka 40 % homologi med varandra och är avlägset besläktade med andra GPCR:er, t.ex. kalciumsensorreceptorn, V2R-feromonreceptorn och de metabotropa glutamatreceptorerna. Alla tillhör GPCR-klass C-familjen och har som utmärkande egenskap en lång extracellulär N-terminal domän som kallas Venusflugfälla-domänen. Genom in situ-hybridiseringsexperiment fastställdes att dessa receptorer uttrycks i 20-30 % av TRC:erna i främre och bakre smaklökar. Vidare finns de hos nästan alla ryggradsdjur, men inte hos ryggradslösa djur.39
Initialt var liganderna för dessa receptorer okända, även om man på grundval av deras uttryck i den främre tungan föreslog söt transduktion. Många spekulerade i att generna för dessa receptorer skulle kartläggas på sac locus, en region på distala kromosom 4 som tidigare genom genetiska studier identifierats som involverad i söt smak hos möss. Fuller42 , som studerade musstammar som skiljer sig åt när det gäller deras benägenhet att konsumera söta lösningar, konstaterade att de flesta skillnaderna i preferens för sackarin hos stammar som smakar och stammar som inte smakar (C57BL/6J respektive DBA/2J) berodde på ett enda locus, kallat sac. Den dominerande formen av allelen är korrelerad med en mer akut preferens. Senare studier generaliserade detta resultat till ytterligare söta molekyler som acesulfam, dulcin och sackaros,43,44 och noterade att förmodade polymorfismer i generna påverkade den perifera nervaktiviteten.45 Med hjälp av genetisk kartläggning med hög upplösning kartlades dock T1R1 proximalt i förhållande till sac-locus.46
Sacks identitet och dess relation till T1R-familjen av receptorer blev tydlig när den tredje familjemedlemmen, T1R3, upptäcktes.47-49 T1R3 uttrycks i både främre och bakre fält i TRCs vars morfologi överensstämmer med typ II-celler. Den samuttrycks med antingen T1R1 eller T1R2, även om en bråkdel av T1R3-uttryckande TRC:er samuttrycker ingendera.50 T1R3-celler samuttrycks med andra delar av den söta transduktionskaskaden som inkluderar α-gustducin och PLCβ2. Försök med heterologa uttryckssystem visade att T1R3 kräver samexpression av T1R2 för att vara fullt mottaglig för en mängd olika söta ämnen som enkelt socker, konstgjorda sötningsmedel, d-aminosyror och söta proteiner.48,51 Den humana T1R2/T1R3-dimeren reagerade på ett tjugotal föreningar som är kända för att vara söta vid fysiologiska koncentrationer och hämmades av lactisol, en mänsklig antagonist för söt smak.51 Genom en kombination av fysisk kartläggning och utvinning av genomdatabaser identifierade flera grupper en T1R3 som sac i gnagarnas och människans genom.47-49,51-54
Validering av T1R2/T1R3 som den huvudsakliga receptorn för söt smak hos däggdjur erhölls genom studier där man använde knockoutmöss för T1R1-, T1R2- eller T1R3-gener, samt en dubbel knockoutmus för T1R2- och T1R3-gener. Dessa möss testades med hjälp av beteendestudier med kortvarig tillgång och elektrofysiologiska registreringar från chorda tympani och glossopharyngeala nerver.55,56 T1R2-nullmöss uppvisade förlust av preferens och neurala reaktioner för artificiella sötningsmedel och kraftigt minskade reaktioner för naturliga sockerarter. T1R3-nullmöss förlorade beteendemässiga och elektrofysiologiska svar för både umamistimuli och artificiella sötningsmedel och hade kraftigt minskade svar för sockerarter. Endast det dubbla knockout-djuret förlorade helt resterande reaktioner på naturligt socker, vilket tyder på att T1R2 eller T1R3 kan fungera som en monomer eller en homodimer. Faktum är att HEK-293-celler som uttrycker enbart T1R3 från musen reagerade på hög sockerhalt;50 intressant nog observerades inte dessa reaktioner med mänsklig T1R3. Dessa knockout-studier visade otvetydigt att T1R-proteinerna T1R2 och T1R3 spelar en viktig roll för att upptäcka och uppfatta sötma. På samma sätt, i en fascinerande naturlig knockout, förvärvade familjen Felidae en loss-of-function-mutation i T1R2-genen tidigt i evolutionen och har följaktligen förlorat den söta smaken, vilket förklarar katternas likgiltighet för socker.57
Hur kan så få receptorer för sötma förklara det stora antalet arter och individuella skillnader i uppfattningen av sötma? Dessa skillnader kan förklaras av skillnader i gensekvenser mellan arter och av polymorfismer inom en art. Vid heterologt uttryck reagerade endast mänskliga T1R2/T1R3 på aspartam och cyklamat medan receptorer från råttan, som är likgiltig för dessa föreningar, inte gjorde det.51 Ännu mer anmärkningsvärt är att T1R2-nullmusen som uttrycker den mänskliga T1R2-transgenen uppvisade reaktioner på flera molekyler som erkänns som söta av människor och som möss är likgiltiga för.55 Inom en art är det tydligt att flera polymorfismer från flera musstammar tydligt sorterar dessa djurs status som provsmakare och icke-provsmakare.54,58 Dessa polymorfismer verkar inte genom att blockera genuttryck eller proteinöversättning, utan tros snarare störa förmågan att bilda dimerer eller binda sötningsmedel. Hos människor bidrar polymorfismer associerade med T1R3-promotorn till att förklara de välkända skillnaderna i smakkänslighet för sackaros.59
En annan paradox som framträder i samband med upptäckten av söta receptorer är hur så få receptorer kan känna igen ett så varierat utbud av stimuli som kolhydrater, aminosyror, proteiner och konstgjorda sötningsmedel. Struktur-funktionsstudier av dessa receptorer har identifierat flera bindningsdomäner inom dimerkomplexet, vilket förklarar hur en så stor mångfald kan mötas.60,61 Till exempel krävs Venusflugfångets domän i T1R2 för aspartam- och neotambindning, T1R3:s transmembrandomän krävs för cyklamat,62,63 och T1R3:s cysteinrika region krävs för att reagera på det söta proteinet brazzein.64 Lactisol, en sötsaksantagonist, binder till en ficka inom transmembrandomänen hos human T1R3;65 intressant nog förklarar ändringen av två aminosyror i transmembran 5-domänen hos råttreceptorn dess okänslighet för denna antagonist.66 Hittills har alla fyra domänerna i T1R2/T1R3-dimeren – de två N-terminala domänerna och de två transmembrandomänerna – varit inblandade i bindning av ligander, var och en med olika affiniteter till motsvarande ligander.
Många av de experimentella strategier som bekräftade att T1R2/T1R3 är den söta receptorn har på samma sätt bekräftat att T1R1/T1R3 är umamireceptorn. När den mänskliga T1R1/T1R3-dimeren uttrycks heterologiskt reagerar den selektivt på l-glutamat,51 medan musens dimer är mer promiskuös bland sina ligander och reagerar på praktiskt taget alla l- (men inte d-) enantiomerer av de 20 standardaminosyrorna.48,67 Knockout-studier dokumenterar ytterligare att T1R1/T1R3-dimeren är umamireceptorn. Knockout av T1R1 eller T1R3 eliminerade beteendemässiga och elektrofysiologiskt logiska smaksvar på glutamat.55 Dessutom är ett karakteristiskt drag för umamismak att den potentieras av ribonukleotider som inosin-5′-monofosfat (IMP) och guanosin-5′-monofosfat (GMP). Denna förstärkning observeras på samma sätt vid heterologiskt uttryck och saknas hos T1R1- eller T1R3-knockoutmöss. Till skillnad från receptorn för söt smak är umamireceptorns funktionella domäner mindre utforskade. Med hjälp av chimära receptorer, platsstyrd mutagenes och molekylär modellering har man föreslagit en modell för kooperativ ligandbindning där glutamat binder till Venusflugfälla-domänen i T1R1 (nära gångjärnsområdet) och IMP binder till en intilliggande plats som stabiliserar konformationsförändringen.68
Det finns fortfarande en debatt om huruvida T1R1/T1R3-dimeren är den enda funktionella glutamatreceptorn i TRC:er.50,69 Före upptäckten av T1R-familjen rapporterades en unik trunkerad form av mGluR4-receptorn som uttrycks i TRCs som umamireceptorn.70 Det har dock påpekats att denna receptor saknar en stor del av Venusflugfälla-domänen, som är nödvändig för glutamatbindning, och saknar synergi för glutamat och ribonukleotider.50 Dessa egenskaper gör det mindre sannolikt att den är en kandidatreceptor för umami. Svårigheten att särskilja natrium- och glutamatreaktionerna av MSG, de kvarvarande umamireaktionerna hos vissa T1R3-knockoutmöss,56 och minskningen av glutamatreaktionerna för mGluR-antagonister71 lämnar dock frågan om multipla umamireceptorer öppen.