Hur fungerar jonbyteskromatografi?

Kromatografi med jonbyteskromatografi (IEX) är en teknik som ofta används vid rening av biomolekyler. Den innebär separation av molekyler på grundval av deras laddning.

Denna teknik utnyttjar interaktionen mellan laddade molekyler i ett prov och motsatt laddade enheter i den stationära fasen i kromatografimatrisen. Denna typ av separation är svår att genomföra med andra tekniker eftersom laddningen lätt kan manipuleras av pH-värdet på den buffert som används.

Två typer av jonbytesseparation är möjliga – katjonbyte och anjonbyte. Vid anjonbyte är den stationära fasen positivt laddad medan den vid katjonbyte är negativt laddad.

Princip för jonbyteskromatografi

IEX-kromatografi används vid separation av laddade biomolekyler. Råprovet som innehåller laddade molekyler används som vätskefas. När det passerar genom den kromatografiska kolonnen binder molekylerna till motsatt laddade platser i den stationära fasen.

Molekylerna som separeras på grundval av sin laddning elueras med hjälp av en lösning med varierande jonstyrka. Genom att låta en sådan lösning passera genom kolonnen sker en mycket selektiv separation av molekylerna enligt deras olika laddningar.

Tekniken

De viktigaste stegen i jonbyteskromatografiförfarandet anges nedan:

• Ett orent proteinprov laddas in i jonbyteskromatografikolonnen vid ett visst pH.
• Laddade proteiner kommer att binda till de motsatt laddade funktionella grupperna i hartset
• En saltgradient används för att eluera separerade proteiner. Vid låga saltkoncentrationer elueras proteiner med få laddade grupper och vid högre saltkoncentrationer elueras proteiner med flera laddade grupper.
• Obönskade proteiner och föroreningar avlägsnas genom att kolonnen tvättas.

En pH-gradient kan också användas för att eluera enskilda proteiner på grundval av deras isoelektriska punkt (pI), dvs. den punkt vid vilken aminosyrorna i ett protein har en neutral laddning och därför inte vandrar i ett elektriskt fält. Eftersom aminosyror är zwitterjoniska föreningar innehåller de grupper med både positiv och negativ laddning. Beroende på omgivningens pH-värde har proteiner en positiv, negativ eller noll laddning. Vid sin isoelektriska punkt interagerar de inte med de laddade enheterna i kolonnens harts och elueras därför. En sjunkande pH-gradient kan användas för att eluera proteiner med hjälp av en anjonbytesharts och en stigande pH-gradient kan användas för att eluera proteiner från katjonbyteshartser. Detta beror på att en ökning av den rörliga fasens buffert-pH gör att proteinet blir mindre protonerat (mindre positivt laddat) så att det inte kan bilda en jonisk interaktion med den negativt laddade hartsen, vilket möjliggör eluering. Omvänt kommer en sänkning av pH i den rörliga fasen att få molekylen att bli mer protonerad (mindre negativt laddad_, vilket möjliggör dess eluering.

Hartsval vid jonbyteskromatografi

Ionbyteshartser har positivt eller negativt laddade funktionella grupper som är kovalent bundna till en fast matris. Matriserna består vanligtvis av cellulosa, polystyren, agaros och polyakrylamid. Några av de faktorer som påverkar valet av harts är anjon- eller katjonbytare, flödeshastighet, svag eller stark jonbytare, hartsens partikelstorlek och bindningskapacitet. Stabiliteten hos det aktuella proteinet dikterar valet av en anjon- eller katjonbytare – endera bytaren kan användas om stabiliteten inte är av betydelse.

Användningarna av jonbyteskromatografi

Ionbytet är den mest använda kromatografiska metoden för separering och rening av laddade biomolekyler, t.ex. polypeptider, proteiner, polynukleotider och nukleinsyror. Dess utbredda tillämpbarhet, höga kapacitet och enkelhet samt dess höga upplösning är de viktigaste orsakerna till dess framgång som separationsmetod. Jonbyteskromatografi används i stor utsträckning i flera industriella tillämpningar, varav några är följande:

• Separation och rening av blodkomponenter som albumin, rekombinanta tillväxtfaktorer och enzymer.
• Bioteknik – analytiska tillämpningar som kvalitetskontroll och processövervakning
• Livsmedel och klinisk forskning – för att studera vetesorter och korrelationen mellan proteinuri och olika njursjukdomar.
• Fermentering – Kationbyteshartser används för att övervaka fermenteringsprocessen under produktion av ß-galaktosidas.

Fortsatt läsning

• Allt innehåll om kromatografi
• Kromatografi översikt
• Användningar för gaskromatografi och masspektrometri (GC-MS)
• Högpresterande vätskekromatografi (HPLC)
• Vätskekromatografi.Masspektrometri (LC-MS) Tillämpningar

Citeringar

.