Jag tillhör en intressegrupp för hematologi och tycker alltid om att se de fallstudier och frågor som andra tekniker lägger upp. Gruppen är multinationell, så jag ser inlägg från tekniker från hela världen. Det är intressant att se likheterna och skillnaderna i standardmetoder och de roller som tekniker spelar inom olika områden och i olika länder. Det är också intressant att se att vi alla stöter på samma typer av problem och svåra prover!Under de senaste månaderna i denna intressegrupp för hematologi har jag sett många frågor och kommentarer om hur man löser ihopklumpade trombocyter, och jag utnyttjar därför detta tillfälle för att kasta lite ljus över dessa knepiga prover. Det fall som jag presenterar, och bilderna, är en artighet av Abu Jad Caesar, som är laboratorieansvarig på Medicare Laboratories – Tulkarm branch, i Palestina.
Patienten fick en CBC utförd på en Nihon Kohden 6410. WBC var 12,7 x 103μL, impedansplättarantalet var 20 000/μL vid första körningen, andra parametrar verkade inom normala gränser. Provet värmdes upp och ett Na Citrate-rör begärdes för att utesluta pseudothrombocytopeni. efter uppvärmning kördes EDTA-provet på nytt med ett trombocytantal på 0/μL. Na citratröret kördes och antalet trombocyter från instrumentet var 189 000/μL. (Figur 1) På grund av förhållandet mellan blod och antikoagulantia i Na Citrate-röret tillämpades en multiplikator på 1,1, vilket gjorde att antalet trombocyter i Na Citrate-röret uppgick till 207 900/μL. Objektglas togs fram, färgades och undersöktes. Bild 1 visar klumpningen i EDTA-röret. Bild 2 visar utstryket från Na Citrat-röret, utan visuell klumpning.
CBC rapporterades med följande kommentarer: Trombocytklumpning observerad, 2 prover togs för att utesluta trombocytopeni. EDTA-helblodsutstryk hade många trombocytklumpar noterade (EDTA-inducerad trombocytopeni). Slutsats: Trombocyterna är tillräckliga och uppskattas till ca 200 000/μL.
Tillväxtantal inom normalområdet brukar inte ge oss så mycket problem i rapporteringen, även om en viss klumpning förekommer, främst på grund av att de är normala. Adekvata trombocytantal ligger inom ett typiskt referensområde på cirka 150-450 x 103/μL.Om det finns instrumentflaggor för ett onormalt scattergram för trombocyter eller trombocytklumpar rekommenderas att upprepa testet med en annan metod. Om den första räkningen utförs med impedansräkning kan många analysatorer även rapportera optiska eller fluorescerande trombocyträkningar. Vid impedansräkning kan mycket små blodkroppar eller fragment räknas som trombocyter, vilket ger ett falskt förhöjt antal trombocyter. Vid optisk räkning kan stora trombocyter räknas som röda blodkroppar, vilket ger ett falskt minskat antal blodkroppar. Vissa hematologiska analysatorer från Sysmex använder impedansräkning och optisk räkning och har även fluorescerande trombocyträkning som använder ett trombocytspecifikt färgämne och ger exakta trombocyträkningar utan de andra metodernas störningar. Ett normalt trombocytantal, även om det finns klumpar som kan ses på ett utstryck, bedöms fortfarande som normalt (eller kan ibland vara förhöjt).
Trombocytopeni kan å andra sidan vara en utmaning i hematologilaboratoriet. När det gäller trombocytopeni behöver läkarna ett korrekt antal blodkroppar för att diagnostisera, behandla eller övervaka patienterna. Även en liten ökning eller minskning kan vara betydande vid allvarlig trombocytopeni. Med färre trombocyter räknas varje trombocyt!
En av de första frågorna vi måste ställa vid en uppenbar trombocytopeni är om detta är en verklig trombocytopeni eller om det är pseudotrombocytopeni (PTCP). En äkta trombocytopeni representerar en patient med ett lågt antal trombocyter som kan behöva övervakning eller medicinsk intervention. Det kan vara farligt att misstolka trombocytopeni, men det är också farligt att rapportera ett lågt antal blodplättar hos en patient med en falsk trombocytopeni som egentligen inte är trombocytopenisk. Pseudotrombocytopeni eller falsk trombocytopeni definieras som ett artificiellt eller felaktigt lågt antal blodplättar. Vid PTCP beror det låga antalet trombocyter på klumpar som räknas som en trombocyt. (Dessa stora klumpar kan också räknas som WBC, vilket ger ett falskt förhöjt antal WBC).
Vi kan dela in PTCP i två kategorier Trombocytklumpar orsakas oftast av fel före analysen, t.ex. överfyllda eller underfyllda EDTA-rör, koagulerade prover eller en tidsfördröjning mellan provtagning och testning. Teknikerna bör kontrollera röret med avseende på proppar och provvolym och göra en deltakontroll för att hjälpa till att skilja trombocytopeni från PTCP. Men med ett uppenbart ”bra” prov skulle nästa steg vara att göra en utstryksgranskning. Om det finns klumpar på utstryket måste vi bestämma vad som orsakade klumparna. Är det den första kategorin, ett av dessa vanliga föranalytiska problem, eller är det den andra kategorin av PTCP, en in vitro-agglutination av trombocyter? Tillstånd som kan orsaka denna in vitro-agglutination av trombocyter inkluderar kalla agglutininer, multipelt myelom, infektioner, antikardiolipin-antikroppar, höga immunglobulinnivåer, abciximabbehandling och EDTA-inducerad pseudothrombocytopeni. (EDTA-PTCP) Av dessa är EDTA-inducerad pseudothrombocytopeni den vanligaste orsaken. (Nakashima,2016).
När tekniker talar om problem med trombocytklumpar är det oftast för att vi letar efter sätt att lösa eller exakt uppskatta trombocytantalet i dessa prover, och det verkar inte finnas något enkelt svar.Klumparna gör exakt räkning omöjlig och även uppskattningar kan vara mycket knepiga. Hur kan vi uppskatta antalet blodplättar? Ska vi helt enkelt rapportera förekomsten av klumpning med ”verkar normalt”, ”minskat” eller ”ökat”? Eller ska vi dela upp våra uppskattningar i fler intervall för att ge läkarna mer värdefull information? Och vad händer om vårdgivaren vill ha en faktisk räkning för att kunna ge patienten bästa möjliga vård och vi inte kan lösa klumparna? Vad kan vi göra för att tillhandahålla en räkning? Några av de första steg som rekommenderas är att virvla provet i 2 minuter för att bryta upp trombocytklumpar och sedan analysera på nytt. Uppvärmning av proverna kan också hjälpa till att lösa upp trombocytklumparna, särskilt i prover med kalla agglutininer eller som har försenats i testningen och som har transporterats eller förvarats vid rumstemperatur eller lägre. Om klumparna kvarstår och om provet återigen samlas upp ger fortfarande trombocytklumpar, kan ett fel före analysen uteslutas och en EDTA-inducerad pseudothrombocytopeni kan misstänkas. Många laboratorier kommer att låta dra ett annat rör eller använda en annan metod för att hjälpa till att lösa upp klumparna.
Vad är EDTA-inducerad trombocytopeni (EDTA-PTCP)? Detta är inte representativt för en särskild klinisk bild och är inte diagnostiskt för någon sjukdom eller läkemedelsbehandling, utan är ett laboratoriefenomen som beror på förekomsten av EDTA-beroende IgM/IgG-autoantikroppar.Dessa antikroppar binder sig till trombocytmembranglykoproteiner i närvaro av EDTA. EDTA framkallar och förstärker denna bindning genom att exponera dessa glykoproteiner för antikropparna (Geok Chin Tan, 2016). (Geok Chin Tan, 2016) Även om det är ett in vitro-fenomen har patienter med vissa tillstånd, t.ex. maligna neoplasmer, kronisk leversjukdom, infektion, graviditet och autoimmuna sjukdomar, en ökad risk för EDTA-PTCP. EDTA-PTCP har dock också observerats hos patienter som är sjukdomsfria. (Zhang, 2018)
Vad är några alternativa metoder för att hjälpa till att lösa EDTA-inducerad trombocytklumpningsproblematik? Den förmodligen vanligaste är att dra om provet i ett Na Citrate-rör. Både EDTA- och Na Citrate-rör bör dras. Vid en äkta EDTA-PTCP, som i vår fallstudie, bör man se klumpar på utstryket från EDTA-röret och inga klumpar på utstryket från Na Citrate-röret. På grund av volymen av antikoaguleringsmedlet i Na Citrate-röret måste du också tillämpa utspädningsfaktorn 1,1 på räkningen från Na Citrate-röret för att få ett korrekt antal trombocyter. Observera dock att hematologiska analysatorer är FDA-godkända och validerade för användning med EDTA-rör. Om du vill använda ett annat antikoaguleringsmedel måste metoden valideras i ditt laboratorium. Observera också att alternativa metoder i allmänhet bara löser EDTA-PTCP och inte klumpning på grund av andra kalla agglutininer, läkemedel eller sjukdomar. Dessutom är trombocytopeni orsakad av antikoagulantia inte begränsad till EDTA. Den kan också uppstå med citrat och heparin. I en studie fann man att upp till 17 % av patienterna med EDTA-PTCPalso uppvisade detta fenomen med citrat. Faktum är att forskare har funnit, och vi har funnit i våra egna valideringar, att vissa prover som inte klumpar ihop sig i EDTA faktiskt klumpar ihop sig i Na Citrate. Det är alltså inte säkert att alternativa rör löser all trombocytklumpning. (Geok Chin Tan, 2016)
Vissa laboratorier har validerat ACD-rör (citronsyra, trinatriumcitrat, dextros) för antikoagulantia för EDTA-PTCP. Med denna metod måste EDTA-röret och ACD-röret köras parallellt och en konverteringsfaktor tillämpas, som återspeglar skillnaden i provutspädning i de två rören. En parameter, t.ex. RBC, måste väljas för att göra denna jämförelse. Genom att använda en formel som dividerar RBC i EDTA med RBC i ACD får man ett förhållande som återspeglar utspädningsskillnaderna mellan antikoagulantia. Detta förhållande kan sedan multipliceras med ACD-trombocytantalet för att erhålla det ACD-korrigerade trombocytantalet. (CAP Today, 2014). Vissa källor har rekommenderat ACD-rör eftersom förekomsten av klumpning med NaCitrat kan vara frustrerande hög. Det finns en teori om att det mer sura ACD-röret kan förhindra att trombocyter klumpar ihop sig bättre än Na Citrate. (Manthorpe, 1981)
Mindre vanligt förekommande tuber är CTAD (trinatriumcitrat, teofyllin, adenosin, dipyridamol) och heparin. CTAD verkar direkt på trombocyter och hämmar trombocytfaktor 4 vilket minimerar trombocytaktiveringen. Nackdelarna med CTAD-rören är att de är ljuskänsliga och måste förvaras i mörker samt att de kan vara kostsamma. De ändrar också förhållandet mellan blodet och den additiva utspädningen så att kalculationer måste användas, som man sett med Na Citrate och ACD. Heparinrör är mindre vanliga när det gäller att lösa problem med trombocytaggregation, eftersom heparin kan aktivera trombocyter. Heparinrör är också dyrare och har därför i allmänhet inte varit ett förstahandsval för EDTA-PTCP.
Jag har hört från tekniker att deras laboratorier har mycket goda resultat när de använder amikacin som tillsätts till EDTA-rören för att förhindra falskt låga trombocytantal hos patienter med EDTA-PTCP. Amikacin bör tillsättas till EDTA-röret inom en timme efter uttag och testerna är stabila i upp till fyra timmar i rumstemperatur. Resultaten av en studie från 2011 visade att tillsats av amikacin till EDTA-röret gav en snabb dissociation av trombocytklumparna med liten eller ingen effekt på morfologi eller indikationer. Denna metod har visat sig vara mycket lovande när det gäller att rapportera exakta trombocytantal hos patienter med PTCP inducerad av multipla antikoagulantia. (Zhou, 2011)
Det sista antikoagulansröret som jag har sett nämnas av många tekniker i hematologins intressegrupp är Sarstedt ThromboExact-rören. Jag har sett många inlägg från tekniker som använder dessa och de verkar ha en mycket god framgång. ThromboExact-rören innehåller magnesiumsalter och är särskilt utformade för att bestämma antalet trombocyter vid PTCP. De är för närvarande validerade endast för trombocytantal och proverna är stabila i 12 timmar efter insamlingen.Intressant nog var magnesium före automatiserade hematologiska analysatorer det antikoaguleringsmedel som användes för manuell trombocytantalräkning. EDTA-PTCP har erkänts sedan EDTA-automatiska trombocyträkningar infördes på 1970-talet. I en studie från 2013 i Tyskland användes ThromboExact-rör med utmärkta resultat för att lösa PTCP orsakad av flera antikoagulantia. Dessa rör blev kommersiellt tillgängliga under studien, 2013. (Schuff-Werner, 2013) Tyvärr finns dessa rör inte tillgängliga i USA. Jag var nyligen på en konferens och gick fram till Sarstedts representanter och frågade om dessa tuber. Jag fick veta att de finns tillgängliga i delar av Europa och Asien men att de inte är FDA-godkända i USA. Jag frågade mycket förhoppningsfullt om de hade för avsikt att få ett FDA-godkännande och fick tyvärr till svar att ”de inte trodde att de hade en marknad som räckte för ett godkännande”.
Oavsett vilken alternativ metod ditt labb väljer att använda, rekommenderas det att man tar ut ett EDTA-rör och det alternativa röret tillsammans. På så sätt kan de två räkningarna och förekomsten eller frånvaron av klumpning i rören jämföras. Vi har många patienter som har haft en förekomst av klumpning, men när vårdgivaren beställer en trombocyträkning med Na Citrate, får vi en ny dragning av både EDTA- och Na Citrate-röret tillsammans, och det finns ingen flaggning eller klumpning med EDTA. I dessa fall är det lämpligt att resultaten från EDTA-analysen redovisas eftersom det inte finns några tecken på EDTA-PTCP.
När en patient har ett lågt PLT-antal utan att någon hematologisk sjukdom, familjehistoria och/eller blödningsbenägenhet identifierats, och föranalytiska fel har uteslutits, bör PTCP övervägas. Detta betyder inte att en patient med PTCP kommer att ha ett normalt antal trombocyter efter det att klumparna har försvunnit. Som nämnts ovan har många patienter med EDTA-PTCP hematologiska eller andra sjukdomar och kan vara verkligt trombocytopeniska. Genom att lösa klumparna hos dessa patienter kan vi ge vårdgivaren ett korrekt antal blodplättar, vilket är mycket viktigt för trombocytopeniska patienter.
Flödesschemat nedan (figur 4) visar några saker att ta hänsyn till vid behandling av trombocytklumpning. Det är vårt mål att lösa klumpning så att vi kan rapportera ett korrekt trombocytantal i tid. I det laboratorium där jag arbetar har jag validerat Na-citratrör, men dessa verkar lösa klumpning hos mindre än 50 % av patienterna. Som en sista utväg för att få ett korrekt antal blodplättar har man i vissa artiklar föreslagit att man skall ta en fingersticka och räkna manuellt. Jag inkluderade detta i journalen som ett alternativ förtianokoagulerande PTCP, men på grund av svårigheten att samla in ett bra prov och subjektiviteten i räkningen, tillsammans med problem som är förknippade med nödvändiga beräkningar, har våra patologer beslutat att vi inte kommer att göra några manuella trombocyträkningar. Av denna anledning är jag för närvarande involverad i övervakningen av trombocytklumpning och kommer att genomföra en liten intern studie för att parallellt jämföra ACD-, CTAD- och Na-citratrör. Beroende på resultaten kan det hända att vi också testar amikacin. Om vi kommer fram till några upplysta slutsatser kommer jag att skriva ytterligare en kort blogg med våra resultat!
Tack än en gång till Abu Jad Caesar, laboratorieansvarig på Medicare Laboratories – Tulkarm branch, i Palestina, som försåg mig med detta läroboksmässigt perfekta fall av PCTP, som lätt kunde lösas genom att man samlade upp i Na Citrate. Vi önskar att alla skulle läsa läroböckerna och vara lika samarbetsvilliga!
- CAPToday, januari 2014. accessed online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmekanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2nd ed. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effektiv uppskattning av korrekt antal trombocyter vid pseudothrombocytopeni med hjälp av ett alternativt antikoagulant baserat på magnesiumsalt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet clumping: En fallrapport och en kort genomgång av litteraturen. Case Reports in Hematology. Volym 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Spurious Thrombocytopenia in AutomatedPlatelet Count. Laboratory Medicine 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacin kan tillsättas till blodet för att minska nedgången i trombocytantalet. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM tog examen från Merrimack College i N. Andover, Massachusetts med en BS i medicinsk teknik och avslutade sin MS i klinisk laboratorievetenskap vid University of Massachusetts, Lowell. Hon har arbetat som medicinsk tekniker i över 30 år. Hon har arbetat inom alla områden av det kliniska laboratoriet, men har ett särskilt intresse för hematologi och blodbanker. När hon inte är upptagen med att vara en galen vetenskapsman kan man hitta henne utomhus när hon cyklar.