Kemikalier och reagenser
GT köptes från marknaden i Taichung, Taiwan. IS (renhet 97 %) erhölls från Alfa Aesar (Lancaster, Storbritannien). 6,7-dimetoxykumarin (6,7-DMC, renhet 98 %) tillhandahölls av Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA). EC (renhet 90 %), ECG (renhet 98 %), EGCG (renhet 95 %), myrsyra, probenecid, fosforsyra (isbar, 85 %) och metylparaben köptes från Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). EGC (renhet 92,7 %) erhölls från ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, USA) och etylacetat av LC-kvalitet från ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). Acetonitril var av LC/MS-kvalitet och köptes från Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA). Serum från fetalt nötkreatur erhölls från Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penicillin-Streptomycin-Glutamin, Dulbecco’s Modified Eagle Medium, trypsin/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution och 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyra köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 erhölls från Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA). 6-Carboxyfluorescein köptes från AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, USA) och 5-carboxyfluorescein från Acros Organics (Geel, Belgien). Milli-Q plus vatten (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) användes för alla preparat.
Förberedelse och karakterisering av GT-infusion
Infusionen framställdes genom att man lät antingen 2 eller 4 g GT dra i 50 ml varmt avjoniserat vatten (98-100 °C) i 30 minuter. Infusionen filtrerades med gasväv medan den var varm för att ge koncentrationer på 40 respektive 80 mg/ml, som administrerades friskt till råttor via gastrisk gavage.
För karakteriseringen av GT-infusionen, efter filtrering av GT-infusionen med 0,2 μm RC15-filter (Sartorious, Goettingen Tyskland), blandades 100 μL av filtratet med 900 μL metanol och centrifugerades för att avlägsna utfällningen. Den korrekt utspädda infusionen (50 μL) kombinerades med 50 μL 6,7-DMC-lösning (2,0 μg/mL i metanol) som intern standard och 5 μL var föremål för LC-MS/MS-analys. HPLC-systemet omfattade Accela 1250-pump och automatisk provtagare (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Den kromatografiska separationen gjordes med hjälp av en Phenomenex® C18 analytisk kolonn (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) med ett förfilter. Den rörliga fasen bestod av acetonitril innehållande 0,01 % myrsyra (A) och vatten innehållande 0,01 % myrsyra (B) och programmerades i en gradient enligt följande: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) och 2/98 (12 min). Flödeshastigheten var 0,2 mL/min. Kolonnutflödet detekterades med H-ESI (heated-electrospray ionization) -II-sond med Quantum Access MAX trippelstegsquadrupol (TSQ) masspektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Kväve användes som hölje gas vid 35 godtyckliga enheter och hjälpgas vid 10 godtyckliga enheter. Kollisionsenergin ställdes in på -19/18 V, sprutspänningen på -3000/3000 V, kapillärtemperaturen på 350 °C, förångningstemperaturen på 350 °C och rörlinsens offset på -80/88 V. Följande massövergångar användes för analysen av utvald reaktionsövervakning (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) och 6,7-DMC (207/151). ESI-MS-spektren registrerades i negativt jonläge för EC, EGC, ECG och EGCG och positivt jonläge för 6,7-DMC.
Djur
Manliga Sprague-Dawley-råttor (270-360 g) köptes in från National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) och hölls i en konditionerad miljö med 12 timmars ljus-/mörkercykler. Mat och vatten erhölls ad libitum fram till 12 timmar före experimenten. Råttorna delades in i två grupper. I det första experimentet användes 28 råttor för att fastställa effekten av GT på serumnivåerna av IS och PCS hos CRF-råttor. I det andra experimentet användes 14 råttor för att utvärdera effekten av GT på njurfunktionen hos CRF-råttor. Alla djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i ”The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)” som publicerats av Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C. Försöksprotokollet hade granskats och godkänts den 08/01/2014 (Tillståndsnummer: 103-126-N) av Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Etablering av CRF-modell och administrering av GT-infusion
CRF inducerades via oral administrering av adenin enligt tidigare studier, men med vissa ändringar19,23,35,36. Kortfattat administrerades adenin suspenderat i 0,5 % metylcellulosa 400 (15 mg/ml) oralt till 28 råttor via magmunnen två gånger dagligen i sju på varandra följande doser (15 mg/råtta) under hela försöksperioden. På dag 4 bestämdes serumnivåerna av IS. Efter bekräftelse av försvagad njurfunktion genom signifikant förhöjda IS-nivåer i serum delades CRF-råttorna in i tre grupper (8-10 råttor i varje grupp) med jämförbara IS-nivåer. Den första gruppen fick 400 mg/5 mL/kg GT-infusion två gånger dagligen i sju på varandra följande doser, den andra gruppen fick 200 mg/5 mL/kg GT två gånger dagligen i sju på varandra följande doser och den tredje gruppen fick 5 mL/kg vatten parallellt som kontroll. På dag 8 administrerades råttorna den sjunde dosen GT kl. 9.00 på morgonen efter nattfastan och blodproverna samlades in 0, 15, 30, 60, 120, 180 och 360 minuter efter doseringen. Den schemalagda tiden för blodprovstagning och administrering av adenin och GT sammanfattas i figur 3. Vid varje provtagningstillfälle togs 0,5 ml blod ut under isofluranbedövning. Blodproverna samlades upp i mikrorör och centrifugerades vid 10 000 g i 15 minuter för att erhålla serum, som förvarades vid -20 °C före analys.
Bestämning av koncentrationerna av IS och PCS i serum
För bestämning av IS- och PCS-koncentrationer i serum vortexades 50 μl serumprov med 200 μl metanol som innehöll 10 μg/mL 6,7-DMC respektive 100 μg/mL metylparaben som interna standarder och centrifugerades för att avlägsna utfällningen, varefter en alikvot på 20 μl utsattes för HPLC-analys.
För kalibratorpreparat spikades 50 μL serum med en serie koncentrationer av IS och PCS för att ge koncentrationsområden på 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) respektive 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM). Det senare förfarandet följde det som beskrivs ovan för serumprover. Kalibreringskurvorna ritades genom linjär regression av förhållandet mellan topparean (IS eller PCS och intern standard) mot kända koncentrationer av IS respektive PCS.
HPLC-apparaten omfattade en pump (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japan), en fluorescensdetektor (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) och en automatisk injektor (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japan). Apollo C18-kolonnen (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) var utrustad med en skyddskolonn (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Japan). Den rörliga fasen bestod av acetonitril (A)-0,1 % fosforsyra (B) och programmerades i en gradient enligt följande: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) och 15/85 (24-35 min) för IS och 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) och 16/84 (24-36 min) för PCS. Detektorinställningarna var Ex 280 nm/Em 375 nm för IS och Ex 214 nm/Em 306 nm för PCS. Flödeshastigheterna var 1,0 mL/min.
Effekt av GT på Cr och BUN hos CRF-råttor
I ett annat experiment användes samma djurprotokoll som nämnts ovan och koncentrationerna av Cr och BUN bestämdes före adeninbehandling (dag 0), före GT-dosering (dag 4) och efter den sjunde dosen av GT (dag 8). Efter att ha bekräftat försvagad njurfunktion genom signifikant förhöjning av Cr och BUN på dag 4 delades CRF-råttorna in i två grupper (7 råttor per grupp) med jämförbara Cr-nivåer. Den första gruppen fick 400 mg/5 mL/kg GT två gånger dagligen i sju på varandra följande doser; den andra gruppen fick 5 mL/kg vatten parallellt som kontroll. På dag 8 fick råttorna den sjunde dosen GT och vatten efter nattfastan och blodproverna togs 30 minuter senare. Cr bestämdes med en kinetisk alkalisk pikratmetod i ett ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). BUN bestämdes med hjälp av ureas/glutamatdehydrogenas-kopplad enzymreaktion i samma analysator.
Cellinjer och odlingsförhållanden
Konstruktionen av de stabilt transfekterade cellinjer som användes för transportstudier, Chinese hamster ovary (CHO)-celler som uttrycker hOAT1 (CHO-hOAT1), humana embryonala njurar 293 (HEK)-celler som uttrycker hOAT3 (HEK-hOAT3) och motsvarande tomvektortransfekterade kontrollcellinjer, har beskrivits tidigare40,41. CHO-cellerna hölls vid 37 °C med 5 % CO2 i DMEM F-12-media (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) innehållande 10 % serum, 1 % penicillin/streptomycin och 1 mg/mL G418. HEK-cellerna hölls vid 37 °C med 5 % CO2 i DMEM high glucose media (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) innehållande 10 % serum, 1 % penicillin/streptomycin och 50 μg/mL hygromycin B. Cellerna odlades i Poly-D-Lysin-belagda skålar.
Förberedelse och karakterisering av serummetaboliter av GT (GTM)
För att efterlikna de molekyler som interagerar med OAT:erna in vivo framställdes GTM från råttor och karaktäriserades. Kortfattat administrerades GT-infusion (800 mg/10 ml/kg) oralt till råttor som fastade över natten. Blodet samlades upp 15 minuter efter doseringen av GT-infusionen. Efter koagulering samlades serumet upp och vortexades med 3-faldig metanol. Efter centrifugering vid 10 000 g i 15 minuter koncentrerades supernatanten i en roterande förångare under vakuum till torrhet. En lämplig volym vatten tillsattes till resterna, vilket gav en lösning med 10 gånger serumkoncentrationen, som delades upp i alikvotar och förvarades vid -80 °C för senare användning.
En del av GTM karakteriserades enligt en tidigare metod med vissa modifieringar16,46. Kortfattat blandades 100 μl serumprov med 50 μl sulfatas (innehållande 1000 enheter/ml sulfatas och 39 861 enheter/ml ß-glukuronidas), 50 μl askorbinsyra (200 mg/ml) och inkuberades vid 37 °C i 45 minuter under anaeroba förhållanden. Efter hydrolysen tillsattes serumet till 50 μL 0,1 N HCl och separerades sedan med 250 μL etylacetat (innehållande 100 ng/mL 6,7-DMC som intern standard). Etylacetatskiktet avdunstades under N2 till torrhet och återställdes med en lämplig volym rörlig fas före LC-MS/MS-analysen. Den mobila fasen bestod av acetonitril (A) – vatten innehållande 0,1 % myrsyra (B) och programmerades i en gradient enligt följande: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) och 2/98 (12 min). Flödeshastigheten var 0,2 ml/min.
Effekter av GTM på den upptagstransport som förmedlas av hOAT1 och hOAT3
CHO-hOAT1- och HEK-hOAT3-celler (1 × 105 celler/brunn) odlades i en 96-brunnsplatta. 6-Carboxyfluorescein (6-CF) och 5-carboxyfluorescein (5-CF) användes som prober för att utvärdera effekten av GTM på aktiviteten hos hOAT1 respektive hOAT347,48. Dessutom användes probenecid (80 μM) som en positiv kontroll för hämning av hOAT1 och hOAT349. Efter 24 h eller 48 h inkubation av CHO-hOAT1 eller HEK-hOAT3 avlägsnades mediet och tvättades tre gånger med PBS-buffert. Före transportexperimentet förinkuberades CHO-hOAT1- och HEK-hOAT3-cellerna med testämnen (GTM och probenecid) vid 37 °C. Efter 30 minuters inkubation tillsattes sedan 6-CF eller 5-CF och inkuberades i ytterligare 5 minuter respektive 10 minuter. Plattorna placerades omedelbart på isbad och supernatanterna avlägsnades och cellerna tvättades tre gånger med iskall PBS. Därefter tillsattes 100 μl 0,1 % Triton X-100 för att lysera cellerna och fluorescensen mättes med excitation vid 485 nm och emission vid 528 nm. För att kvantifiera proteininnehållet i varje brunn tillsattes 10 μL celllysat till 200 μL utspätt proteinanalysreagens (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) och den optiska densiteten mättes vid 570 nm. Den relativa intracellulära ackumulationen av 6-CF eller 5-CF beräknades genom att jämföra med kontrollerna efter proteinkorrigering.
Dataanalys
Den högsta serumkoncentrationen (Cmax) erhölls från experimentell observation. Arean under serumkoncentrationen – tidskurvan (AUC0-t) beräknades med hjälp av trapezoidregeln till den sista punkten. Skillnaderna i IS och PCS mellan tre grupper analyserades med hjälp av envägs ANOVA, medan skillnaden i Cr och BUN mellan två grupper analyserades med hjälp av oparade Students t-test, med p < 0,05 som signifikant nivå. Oparat Student’s t-test användes också för analys av in vitro-analyser.