Funktionen av chaperonproteiner i sammansättningen av proteinkomplex som är involverade i adhesions- och fusionsprocesser för könsceller

Multiproteinkomplex i spermiekapacitering och ZP-interaktion

När de når befruktningsplatsen, ampullan, måste spermier tränga igenom två barriärer innan de kan smälta samman med äggcellens plasmamembran, eller oolemma. Den första av dessa är ett hyaluronsyrarikt stratum av cumulusceller som omger oocyten och den andra är den extracellulära matrisen i själva oocyten, ZP (Hartmann et al. 1972). Trots utvecklingen av både ZP- och hyaluronsyrabindningsställen under spermatogenesen och förvärvet av bindningspotential när spermatozoerna passerar epididymis, kräver dessa celler en distinkt period av vistelse i det kvinnliga reproduktionssystemet innan de framgångsrikt kan delta i sådana interaktioner (Austin 1951, Chang 1951). De kollektiva förändringar som spermatozoerna genomgår i denna miljö, som kallas kapacitering, gör det möjligt för cellerna att reagera på signaler från cumulus-ocytkomplexet och slutföra en process av akrosomal exocytos, vilket gör dem kompetenta för fusion med oolemma.

ZP består av en serie sulfoglykoproteiner, nämligen ZP1, ZP2 och ZP3, som är mycket konserverade hos de flesta däggdjursarter (även om ytterligare en ligand, ZP4/B, har rapporterats i oocyter från människa och gris) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Det anses allmänt att dessa ligander styr spermabindningen hos de flesta arter (se även Reid et al. (2011)). Anmärkningsvärt är dock att olika modeller för närvarande fortfarande övervägs när det gäller identiteten hos den primära spermiereceptorn inom ZP och de mekanismer genom vilka spermatozoer fäster vid denna matris (se även Visconti & Florman (2010)). På samma sätt har undersökningar av identiteten hos motsvarande receptor(er) på spermiernas yta som känner igen lämplig(a) ligand(er) på ZP också misslyckats med att ge definitiva svar. Det finns faktiskt en växande litteratur om murin knockouts av lovande receptorproteinkandidater (inklusive β-1,4-galaktosyltransferas (GALT1), arylsulfatas A (ARSA) och spermieadhesionmolekyl 1 (SPAM1); för en fullständig lista, se Ikawa et al. (2010))) som var och en misslyckas med att resultera i fullständig infertilitet (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Snarare uppvisas olika grader av minskad bindningsförmåga, vilket ger upphov till möjligheten att denna process omfattar en viss grad av funktionell redundans och att ett antal spermieproteiner agerar i samverkan för att förmedla ZP-adhesion. Samordningen av aktiviteten hos dessa proteiner för att säkerställa produktiva ZP-interaktioner håller därför på att växa fram som ett viktigt forskningsfokus.

I de flesta eutheriska däggdjur tros spermiekapacitering inledas genom aktivering av en cAMP-medierad väg som kulminerar i tyrosinfosforylering av flera spermieproteiner (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Molekylära chaperoner har en framträdande plats bland dessa proteiner, med HSP90AA1, HSP90B1 och HSPD1 bland de proteiner som visat sig uppvisa tyrosinfosforylering till följd av kapacitering (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). Aktuella modeller tyder på att fosforyleringen av dessa chaperoner under kapacitering utlöser deras aktiva roll i sammansättningen av ZP-igenkänningsproteiner till komplex och/eller translokationen av dessa komplex till spermatozoernas yta som förberedelse för befruktning (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Utöver denna indirekta roll vid vidhäftning av könsceller har chaperoner på spermiernas yta också förmodade funktioner som vidhäftningsmolekyler som förmedlar igenkänning av sulfoglykolipider under bindning av könscellerna (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Nyligen har tekniken blå native PAGE (BN-PAGE), som ursprungligen utvecklades för analys av elektrontransportkedjans multienzymkomplex (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), anpassats för bedömning av multimera spermieytkomplex hos möss och människor (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Denna teknik möjliggör elektroforetisk upplösning av nativa proteinkomplex som behåller sin biologiska aktivitet. I spermier från människa och mus har användningen av BN-PAGE parallellt med Far-Western blotting med hela solubiliserade zonae avslöjat flera primära multiproteinkomplex som har affinitet för homologa ZP (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Ett sådant komplex har rapporterats bestå av proteinkomponenterna i CCT/TRiC-komplexet (CCT1-CCT8), en dubbelringstruktur som fungerar som en molekylär chaperon med en nyckelroll i regleringen av bildandet av multiproteinkomplex (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Putativa bevis i form av samimmunoprecipitations-, samlokaliserings- och proximitetsligeringsanalyser har identifierat ZP-bindningsprotein 2 (ZPBP2) som ett av de mest övertygande klientproteinerna för CCT/TRiC-komplexet i mogna spermier (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Ursprungligen involverad i sekundär ZP-bindning har en nyare studie visat att hanmöss som är noll för ZPBP2 är subfertila och uppvisar defekter i ZP-interaktion och penetration (Lin et al. 2007). Hos möss finns det ytterligare bevis för att vissa CCT/TRiC-komplexunderenheter translokeras till spermieytan under spermiekapacitering (Dun et al. 2011).

En annan framträdande klass av chaperoner som har identifierats på spermieytan och som är inblandade i regleringen av ZP-interaktioner är HSP70-familjen (Naaby-Hansen et al. 2010). I likhet med CCT/TRiC-komplexet har chaperoner från HSP70-familjen också väldokumenterade roller när det gäller att underlätta både transmembranproteintransport och sammansättning av stabila proteinkomplex (Mayer & Bukau 2005). En medlem av HSP70-familjen som uppvisar exklusivt (mus) eller dominerande (människa) uttryck i testiklarna verkar vara nödvändig för manlig fertilitet. Ett avvikande uttryck av denna chaperon, HSPA2, har korrelerats med en fenotyp av allvarlig manlig infertilitet hos människor, vilket särskilt påverkar spermatozoernas förmåga att interagera med homologa oocyter in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Hos både möss och människor har HSPA2 en grundläggande roll i spermatogenesen, och riktad borttagning av proteinet hos den förstnämnda arten leder till ett tidigt stopp i denna process och en samtidig avsaknad av spermatozoer (Eddy 1999). Hos människor har uttrycksnivåerna för HSPA2 korrelerats positivt med hur framgångsrik befruktningen in vitro är (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) och kan därför påstås kunna förutsäga fertilitetsstatusen hos män med stor noggrannhet (Ergur et al. 2002).

Karakterisering av HSPA2 i vårt eget laboratorium har visat att detta chaperon finns i den akrosomala domänen hos mänskliga spermier och är en komponent i minst fem proteinkomplex med hög molekylmassa (Redgrove et al. 2012), inklusive en undergrupp av dem som tidigare visats ha ZP-affinitet (Redgrove et al. 2011). I överensstämmelse med dessa uppgifter har vi säkrat bevis för att det mest dominerande av HSPA2-komplexen innehåller ytterligare två proteiner, som båda tidigare har involverats i spermie-zona-interaktioner (Redgrove et al. 2012). Vidare har vi, i överensstämmelse med de publicerade resultaten från Huszar et al., kunnat påvisa en betydande minskning av HSPA2-nivåerna i spermatozoerna hos män med isolerade skador i deras förmåga att delta i interaktioner med ZP i homologa oocyter in vitro (Redgrove et al. 2012). Vårt nuvarande arbete fokuserar på om underskottet i ZP-adhesion antingen beror på avvikande bildning av ZP-bindningsställen i de tidiga stadierna av spermiogenesen (Huszar et al. 2000) eller om det kan vara ett resultat av HSPA2:s oförmåga att delta i händelser som rör ommodellering av spermieytan under kapacitering, t.ex. genom att underlätta sammansättning och/eller presentation av ZP-receptorer på spermieytan som en förberedelse för ZP-interaktion.

Inom vårt eget arbete med sammansättningen av spermiernas ytkomplex har Han et al. oberoende av varandra identifierat ett alternativt chaperonladdat multiproteinkomplex på ytan av spermaceller från mus. Intressant nog, vilket dokumenterats ovan, samlas detta komplex, som består av HSPA5, calnexin, integralmembranprotein 2B och ADAM7, uppenbarligen under kapacitering (Han et al. 2011). Även om funktionen hos detta komplex ännu inte är helt klarlagd har uttrycket av ADAM7 kopplats till närvaron av ytterligare ADAM-proteiner, ADAM2 och ADAM3 (Kim et al. 2006), som är viktiga för vidhäftning av spermatozoer till ZP (Muro & Okabe 2011). Dessutom är det känt att HSPA5 är involverad i främjandet av vidhäftning av högkvalitativa spermatozoer till oviduktens epitelceller (OEC) i isthmus i det kvinnliga reproduktionsorganet. Bildandet av denna reservoar tros ha en överlevnadsfrämjande effekt när det gäller att hålla spermier i ett icke-kapaciterat, vilsamt tillstånd som förberedelse för att oocyten ska släppas ut i ampullan (Topfer-Petersen et al. 2002). Intressant nog har chaperonerna HSPD1 och HSPA5 också lokaliserats till ytan av bovin OEC och har därmed involverats i sperma-OEC-bindningen (Boilard et al. 2004).

Också i överensstämmelse med vårt eget arbete har det komplex som identifierats av Han et al. visat sig befinna sig i mikrodomäner i membranen eller lipid rafts, specialiserade områden i membranen som utgör en plattform för funktionell sammansättning och presentation av multiproteinkomplex (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Partitioneringen av chaperonkomplex till raftmiljön har också observerats för HSPA2 i mänskliga spermier (Nixon et al. 2011) och för komponenter av CCT/TRiC-komplexet i musspermier (Dun et al. 2011). Dessa membrandomäner omfattar också ett antal ytterligare förmodade ZP-receptorproteiner, däribland GALT1, ZP3R och SPAM1, vilket förstärker deras roll i ombildningen av spermieytan och i ZP-bindningen (fig. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Den eller de mekanismer genom vilka sådana proteiner rekryteras till lipidflottarna har ännu inte lösts; HSPA2 har dock rapporterats binda via sin ATPasedomän till 3′sulfogalaktosylglycerolipid, det viktigaste glykoproteinet som identifierats i spermiernas lipidflottar (Mamelak & Lingwood 2001).

Förutom lipidflottarnas förmodade roll vid omplacering av viktiga chaperonkomplex och ZP-receptorproteiner finns det också övertygande bevis för att många förmodade ZP-receptorer, såsom ARSA och ZP3R, liksom flera molekylära chaperoner uppvisar en kapacitetsberoende förflyttning från intracellulära platser, t.ex. akrosomet, till spermieytan för att förbereda cellerna inför deras interaktion med ZP (Nixon et al. 2009). Det har föreslagits att intim kontakt mellan det yttre akrosomala membranet och spermiernas plasmamembran förmedlas genom att kompletterande SNARE-proteiner (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) binder varandra, vilket leder till bildandet av fusionsporer som ger en väg för enzymernas vandring till spermieytan innan det akrosomala innehållet försvinner helt och hållet (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). Till stöd för denna modell visade en studie av Brahmaraju et al. (2004) att administrering av antikroppar mot VAMP och SNAP i den akrosomala vesikeln hämmade spermie-ZP-bindningen hos musen.

Denna progressiva priming av spermieytan har väckt frågor om den akrosomala exocytosens allt-eller-inget-natur. Icke desto mindre verkar den funktionella sammansättningen av SNARE-komplex också ligga till grund för de långvariga spermiemembranfusionshändelser som möjliggör en fullständig förlust av det akrosomala innehållet (Tsai et al. 2010). Även om det allmänt anses att kontakt med ZP initierar denna akrosomala exocytos hos de flesta däggdjursarter, har ett antal studier utförda på mus visat att spermatozoer som påbörjar akrosomal exocytos innan de kommer i kontakt med ZP fortfarande kan befrukta oocyten (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Detta fenomen kan även gälla för spermier från marsvin (Huang et al. 1981) och hamster (Yanagimachi & Phillips 1984). Sådana resultat tyder på att cumulus oophorus spelar en viktig roll för initieringen av akrosomreaktionen och ger upphov till oro när det gäller förmågan hos in vitro-studier som utförs med cumulus-avslitna zonastrukturer i oocyten att korrekt rapportera om akrosomreaktionens sanna natur och faktiskt ZP-interaktionen.

Trots denna kontrovers har chaperonliknande molekyler också involverats i akrosomal exocytos genom sin förmåga att främja sammansättningen av glutamininnehållande SNAREs (Q-SNAREs) och arginininnehållande SNARES (T-SNAREs) till täta ternära komplex (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Intressant nog har eleganta studier på grisar visat att kapacitering inducerar stabil dockning av spermiernas plasmamembran med det yttre akrosomala membranet som förberedelse för befruktning (Tsai et al. 2010). Nyare studier utförda av Tsai et al. (2012) har också gett bevis för närvaron av unilamellära blandade vesiklar som, bland andra viktiga funktioner, möjliggör rekrytering av sekundära ZP-bindande proteiner på spermieytan och som har ett nytt trimeriskt SNARE-komplex som består av syntaxin 3, SNAP23, VAMP2 och ytterligare ett protein, complexin 2. Den energi som frigörs vid bildandet av sådana komplex används i sin tur för att initiera membranfusion genom att dra ihop plasmamembranet och det inre akrosomala membranet i spermatozonen (Tomes et al. 2002). Slutförandet av denna process är avgörande för exponeringen av spermiernas domäner som deltar i befruktningens nedströmshändelser: oolemma-bindning och fusion.