Inledande problemRedigera
TermolabilitetRedigera
Den första tillämpningen av FLP-FRT-rekombinaset fungerade inte hos däggdjur. FLP-proteinet var termolabilt (denatureras vid förhöjda temperaturer) och var därför inte användbart i däggdjursmodellen på grund av förhöjda kroppstemperaturer hos dessa modellsystem. På grund av patent och restriktioner för användningen av Cre-Lox-rekombination har man dock lagt stor vikt vid att ta fram en mer termostabil FLP-FRT-kassett. Några av de första resultaten producerades av Buchholz et al. (1997) genom att använda cykelmutation i Escherichia coli . I sin forskning transfekterade författarna E. coli-celler med två plasmider: en som kodar för slumpmässigt muterade FLP-proteiner nedströms en arabinospromotor och en annan som innehåller en lacZ-genpromotor inom en FRT-kassett. E. coli-plantorna odlades på arabinosplattor vid 37 °C och 40 °C, och om rekombination inträffade skulle lacZ-uttrycket försvagas och kolonierna skulle bli vita. Vita kolonier valdes ut från varje generation och odlades på nya arabinosplattor vid samma tidigare temperaturer i åtta generationer. Efter att rekombinationen bekräftats genom western-blotting och de muterade FLP-generna sekvenserats transfekterades denna åttonde generations FLP-protein (FLPe) till däggdjurscellkultur, och rekombinationen i däggdjursceller bekräftades. Denna variant av FLP har endast fyra aminosyrasubstitutioner: P2S, L33S, Y108N och S294P.
Generering av genetiska mosaikerEdit
Genisk mosaik uppstår i en organism när likartade celltyper uttrycker olika fenotyper på grund av olika genotyper vid specifika loci. Enkelt uttryckt sker detta när en organism innehåller olika genotyper, vilket vanligtvis är sällsynt i naturen. Detta kan dock lätt (och problematiskt) produceras med hjälp av FLP-FRT-rekombination. Om två olika FRT-platser finns i en cell, och FLP finns i lämpliga koncentrationer, kommer FRT-kassetten att fortsätta att skäras ut och införas mellan de två FRT-platserna. Denna process fortsätter tills FLP-proteinerna sjunker under de nödvändiga koncentrationerna, vilket leder till att cellerna i en organism har olika genotyper. Detta har setts från fruktflugor till möss och är urskillningslöst mot specifika kromosomer (somatiska och kön) eller celltyper (somatiska och germina).
Bestämning av cellinjerRedigera
För publikationen av Dymecki et al. (1998) hade Cre-rekombinas använts för cellfate-mappning av neuronala progenitorer hos möss med hjälp av En2-promotorn. Författarna till Dymecki et al. (1998) teoretiserade därför att FLP-rekombinas skulle kunna användas på ett liknande sätt med en liknande effektivitet som Cre-rekombinas i möss. Författarna skapade två transgena muslinjer: en neuronal Wnt1::Flp-fusionslinje och en linje som hade FRT-kassetten som flankerade det 18:e exonet av tm1Cwr. Författarna valde denna exon för excision eftersom den resulterar i en nollfenotyp om den excideras. Författarna parade de två linjerna och lät avkomman nå vuxen ålder innan avkomman offrades. RNA-extraktion utfördes på neuronal, muskulär, enterisk och svansvävnad. PCR med omvänd transkription och northern blotting bekräftade att excisionen av det 18:e exonet av tm1Cwr förekommer rikligt i hjärnvävnad och måttligt i muskelvävnad (på grund av Scwhann-celler i muskeln). Som förväntat sågs inte excision i andra vävnader. Författarna såg samma, om inte bättre, effektivitet hos FLP-rekombinaset vid bestämning av celltillhörighet än Cre-rekombinas.
I Drosophila melanogaster (fruktfluga)Edit
Hittills har FLP-rekombinaset använts många gånger i D. melanogaster. En jämförelse mellan Flp-rekombinas och Cre-rekombinas i D. melanogaster har publicerats av Frickenhaus et al. (2015). Författarna till Frickenhaus et al. (2015) hade ett tvåfaldigt mål: att karakterisera och jämföra effekten av Flp-rekombinas ”knock-out” med Cre-rekombinas ”knock-out” och RNAi-knockdown och avslöja funktionen av cabeza (caz), flugans ortolog till FUS, i neuronerna och muskelvävnaden hos D. melanogaster. FUS har varit starkt involverad i amyotrofisk lateralskleros (ALS) och frontotemporal demens hos människor . Författarna använde ett elav-Gal4/UAS-Flp- eller Cre-system för att uttrycka rekombinaset specifikt i neuroner och ett Mef2-Gal4/UAS-Flp- eller Cre-system för att uttrycka det specifikt i muskler. Författarna drar slutsatsen att Flp-rekombinasets ”knock-out”-verktyg är effektivare än både RNAi- och Cre-rekombinas för att slå ut specifika gener i specifika vävnader eller cellinjer på grund av avsaknaden av det läckande uttryck som ses i både Cre-proteinet och RNAi-transkriptet. Författarna såg också en toxicitet hos Cre-proteinet som inte ses med Flp-proteinet.
I Danio rerio (Zebrafisk)Edit
Effektiviteten hos FLPe-rekombinassystemet utvärderades i zebrafiskar av Wong et al. (2009). Embryon, som var hemizygota för ett FRT-flankerat förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) nedströms en muskelspecifik promotor, injicerades med FLPe-proteinet. Utan FLPe bör dessa embryon uttrycka EGFP i all muskelvävnad, och om de korsas med en vildtypsträng bör 50 % av den resulterande avkomman också uttrycka EGFP i muskelvävnad. Embryon som injicerats med FLPe hade betydligt mindre uttryck av EGFP i muskelvävnad, och mosaikism sågs också. När dessa embryon nådde vuxen ålder parades de med en vildtypstam, och de resulterande kullarna hade betydligt färre avkommor som uttryckte EGFP i muskelvävnad (0-4 %). Dessa resultat visar att FLPe inte bara är mycket effektivt i somatiska celler, utan även i zebrafiskens könsceller,
I växterEdit
Skapande av ”fytosensorer” eller ”sentineller” i Arabidopsis thaliana och TobaccoEdit
Fytosensorer är genetiskt modifierade växter som kan rapportera närvaron av biotiska eller abiotiska föroreningar. Det är uppenbart att produktionen av dessa genmodifierade växter har stora löften för jordbruket och laboratoriet. Det har dock visat sig vara problematiskt att skapa en lämplig reportervektor. cis-regulatoriska element spelar en viktig roll vid transkriptionsaktivering av gener i växter, och många av dem är inte välkända. Många fytosensorer uttrycker antingen för lite av sina reportergener eller rapporterar falskt positiva resultat på grund av syntetiska promotorer. Författarna till Rao et al. (2010) använde sig av FLP-rekombinas-verktyget för produktion av en mycket effektiv fytosensor. Författarna använde en värmeschockpromotor för att inducera produktionen av FLP medan en FRT-flankerad vektor separerade CaMV 35S-promotorn från betaglukuronidasgenen (GUS). När plantorna utsattes för värmeslag ledde FLP-induktionen till att den FRT-flankerade vektorn skildes ut, vilket innebar att GUS-genen flyttades direkt nedströms från CaMV 35S-promotorn. Aktiveringen av GUS ledde till att växternas blad förändrades från grönt till blått; därmed rapporterade fytosensorn effektivt stress till modellsystemet!
Med Cre-rekombinasEdit
Produktion av det gate-way-ready inducible MiRNA (GRIM)-expressionssystemetEdit
RNA-interferens (RNAi) har orsakat ett paradigmskifte i fråga om uttrycket av gener och potentiella genknockouts hos eukaryoter. Innan produktionen av GRIM-expressionssystemet var skapandet av RNAi-vektorer dyrt och tidskrävande. Vektorerna framställdes genom den traditionella copy-and-paste-metoden för molekylär kloning. Garwick-Coppens et al. (2011) utvecklade en mycket effektivare metod för produktion av RNAi-vektorer där uttrycket av RNAi kan slås in med hjälp av Cre-rekombinas och slås ut med hjälp av Flp-rekombinas. Det nya GRIM-expressionssystemet gör det möjligt att mycket snabbare generera expressionsvektorer som innehåller konstgjorda RNAi-konstruktioner. Författarna fortsatte med att visa att deras uttryckssystem fungerar ganska effektivt i humana embryonala njurar (HEK-celler), en vanlig mänsklig odödlig cellinje inom molekylär forskning.