FFPE-prover – Förberedelse av prover från mänsklig vävnad – Lab-Ally

Innehållsförteckning

Introduktion |Vävnadsförvärv |FFPE-vävnadsbearbetning |Sectioning | Referenser

Om du behöver FFPE-prover eller andra mänskliga biologiska prover för din forskning, vänligen kontakta oss.

Introduktion

Många av dagens forskare föredrar att använda FFPE-prover av vävnader för sina IHC-, histologiska eller in-situ genomiska analyser. FFPE står för ”Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” och beskriver de två huvuddragen i denna metod för vävnadskonservering. Formalin är en formaldehydlösning och har använts sedan den tyske läkaren Ferdinand Blum i slutet av 1800-talet upptäckte formaldehyds konserverande effekter (Fox, et al., 1985). Paraffin infunderas i vävnaden efter fixering med formaldehyd, och vävnaden omges också av ett paraffinhölje för att hjälpa till att stödja den och skydda den från oxidation. Professionellt fixerade och inbäddade FFPE-prover och de biomolekyler de innehåller är relativt stabila vid omgivningstemperaturer. Strukturellt sett är de fixerade och inbäddade vävnaderna motståndskraftiga och kan användas för mikroskopiska anatomistudier nästan på obestämd tid, men med tiden kommer antigeniciteten hos vissa proteiner att försämras, vilket begränsar IHC-studier till prover som inte är äldre än några decennier. Dubbelsträngat DNA är förvånansvärt stabilt i FFPE-block, men andra mindre stabila biomolekyler, t.ex. RNA, kan brytas ned inom ett decennium eller mindre, särskilt när sektioner har skurits.

Arkiv som ackumulerar ett stort antal FFPE-prover är en särskilt rik datakälla när en jämförelse av många fall (dvs. FFPE-prover från flera givare) är önskvärd för att man ska kunna dra statistiskt robusta slutsatser om egenskaperna hos vissa indikationer. Om FFPE-proverna skall användas i biomedicinsk forskning med höga insatser är det viktigt att varje steg i beredningsprocessen utförs av fullt utbildade och certifierade yrkesmän, helst i ett CLIA-certifierat (dvs. statligt inspekterat) eller CAP-ackrediterat (College of American Pathologists) laboratorium.

Det bör noteras att FFPE-processen inte är universellt standardiserad, och institutioner runt om i världen kan använda sig av något olika protokoll med olika formalinlösningar eller på annat sätt skräddarsy processen efter sina preferenser och krav. Nedan följer en översikt över processen och beskrivningar av vad varje steg innebär, samt några vanliga variationer.

Vävnadsanskaffning

Förut för vävnadsbearbetningen är det nödvändiga steget med vävnadsanskaffning. Detta är faktiskt det svåraste elementet att kontrollera eftersom det är sammanflätad med patientvård, 41CFR46-överensstämmelse och i USA, intern tillsyn av IRB (Internal Review Board). Specifikationerna för det medicinska förfarandet och konventionerna för standardvård är viktiga eftersom de kan påverka variabler som tidsintervall mellan administrering av anestesi och ligering av kärl, avlägsnande av vävnaden och den tid som förflyter före fixering, vilka alla kan påverka provets kvalitet. Det är till exempel troligt att förändringar i RNA och proteiner inträffar under tidsintervallet, som kallas varm ischemitid, mellan ligering av blodtillförseln och avlägsnande av vävnad (Dash, et al., 2002). Denna ischemitid kan variera från minuter till timmar beroende på organet, institutionens standardoperationsrutiner, kirurgen och annan involverad vårdpersonal samt det kirurgiska tillvägagångssättet. Därför har det rekommenderats att denna tid registreras för varje prov och att den hålls så kort som möjligt (Hewitt, et al., 2008).

FFPE-vävnadsbearbetning

När vävnadsprovet väl har tagits fram kan det behövas ytterligare triagering, dissektion eller mikrodissektion (kollektivt benämnt grossing) för att isolera och förbereda den specifika vävnadsdel som kommer att passera genom de återstående bearbetningsstegen. Behandlingen av vävnader är idag ofta helt automatiserad fram till det sista steget, inbäddning, som kan utföras manuellt. Det finns många vävnadsprocessorer, men alla följer sekvensen av de fyra första stegen som visas ovan. Automatiseringen av de olika stegen bidrar till att eliminera variationer i förfarandet som en källa till variation av experimentella resultat mellan olika FFPE-prover.

Fixering

Fixering är det första steget i behandlingen av FFPE-vävnad. Kritiska faktorer som måste beaktas är vilken lösning som ska användas, hur lång tid som tillåts för fixering samt tjockleken och de histologiska egenskaperna hos det vävnadsprov som ska fixeras.

– Lösning

Den fixeringsvätska som används av de flesta laboratorier är neutralt buffrat, 10 % formalin. Formalin är en vätska som består av 37-40 % formaldehyd och 10 % metanol (i vikt) i vatten; en 10-procentig formalinlösning innehåller alltså cirka 3,7-4 % formaldehyd och 1 % metanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). I själva verket finns formaldehyd i lösning främst som monomerer eller små polymerer av metylenglykol (metandiol, formaldehydmonohydrat) som bildas genom den reversibla reaktionen av formaldehyd med vatten. Polymerer av metylenglykol med hög vikt kallas paraformaldehyd och fälls ut ur lösningen, men metanol bromsar denna polymeriseringsprocess, vilket är anledningen till att metanol ingår i formalinlösningar. Formalin utspätt med vatten (t.ex. 10 % formalin) – och särskilt om det är en buffertlösning – kommer huvudsakligen att innehålla monomerer eftersom det stora antalet vattenmolekyler bryter upp eventuella metylenglykolpolymerer som normalt skulle ha funnits i en lösning med högre formaldehydkoncentration (Kiernan, 2000). Buffertar, den återstående komponenten i formalin, tillsätts också eftersom formaldehyd har en tendens att oxideras till myrsyra (Fox, et al., 1985). Myrsyra vid vävnadsfixering kan resultera i utfällning av granuler av formalinpigment (surt hematin) som kan likna pigment som produceras av vissa parasiter (Pizzolato, 1976). Buffring av formalin förhindrar detta. Vanliga buffertmedel är magnesiumkarbonat, kalciumkarbonat, citrat, Tris och fosfatbuffertar (Hewitt, et. al., 2008). Kommersiellt formalin innehåller ofta fosfatbuffertar. ”Neutralbuffrad”, som vanligtvis är det sätt på vilket formalin framställs, innebär helt enkelt att pH-värdet hålls på cirka 7.

– Process och mekanism

På grund av de låga molekylvikterna hos formaldehyd och metylenglykol tränger formalin (främst metylenglykol i lösning) in i vävnader relativt snabbt, med en hastighet som beror på vävnadstypen, men med en genomsnittlig hastighet på 1 mm/timme (Hewitt, et al., 2008). Protokollen för fixering kommer därför att variera beroende på vilken typ av vävnad som ska fixeras. När de väl är inne i vävnaden kommer den del av formaldehydmolekylerna som finns i lösningen att börja korslänka sig med proteiner, men detta sker med en mycket långsammare hastighet än diffusionshastigheten. Formaldehydets reaktion med vävnaden drar ut det ur lösningen och drar den reversibla reaktionen mellan formaldehyd och metylenglykol tillbaka i riktning mot formaldehyd, så att mer formaldehyd produceras samtidigt som det förbrukas (Fox, et al., 1985). Lysins aminosidokedjor är de mest reaktiva med formaldehyd, men andra som är något reaktiva med formaldehyd är arginin, asparagin, histidin, glutamin, serin och tyrosin (Howat och Wilson, 2014). Efter reaktionen kan den resulterande hydroximetylgruppen som är knuten till komplexet sedan ytterligare reagera med samma protein eller andra proteiner och på så sätt bilda stabila metylenbryggor (protein-CH2-protein) (Kiernan, 2000). Det är detta som ger upphov till olösligheten och styvheten hos vävnader som har formalinfixerats och därmed konserverats. Det krävs ungefär 24-48 timmar för att denna tvärbindning ska ske tillräckligt i hela vävnaden (Thavarajah, et al., 2012), men det har rekommenderats att inte tillåta mer än 36 timmar för denna process eftersom fixering under en längre tid kommer att försämra kvaliteten på biomolekylerna i FFPE-proverna, t.ex. genom att förkorta längden på de nukleinsyror som kan extraheras (Hewitt, et al, 2008).

– Begränsningar

Den stora fördelen med att använda formaldehyd – särskilt som neutralt buffrat, 10 % formalin – är att det bevarar ett brett spektrum av vävnader och komponenter. Det har dock begränsningar. Till exempel används vanligtvis en kombination av formaldehyd och glutaraldehyd (C5H8O2), eller en lösning av enbart glutaraldehyd, för elektronmikroskopi (Kiernan, 2000) eftersom dessa lösningar är bättre för att bevara vävnadsstrukturer för detta ändamål. Observera att vävnader som preparerats med en glutaraldehyd- eller glutaraldehyd-aldehydlösning inte kommer att betraktas som FFPE-prover. En annan utmaning är att hämta DNA- och RNA-molekyler från FFPE-vävnad eftersom formalin tenderar att modifiera nukleinsyror – till och med till den grad att det införs konstgjorda mutationer i DNA – och bryta upp dem i små fragment (Srinivasan, Sedmak och Jewell, 2002). Ändå är det möjligt att extrahera DNA- och RNA-fragment från FFPE-vävnad som är lämpliga för analys, vilket beskrivs i ett protokoll skrivet av Tang, et al. (2009), där en nyckelfaktor för nukleinsyraåtervinning är lämplig proteasedbrytning. Kommersiella kit för nukleinsyreutvinning från FFPE-prover finns också tillgängliga.

– Provets tjocklek

En annan viktig punkt att ta hänsyn till när det gäller formalinfixering är vävnadsprovets tjocklek. Även om formalin penetrerar vävnad relativt snabbt, som nämnts ovan, kommer vävnadens tjocklek att påverka kvaliteten på det fixerade provet. Det kommer att krävas mer tid för formalin att nå mitten av tjockare vävnadsprov. Medan formalin gradvis diffunderar in i provets innersta delar har de yttre regionerna redan påbörjat fixeringsprocessen, så att biomolekylerna där är mer benägna att brytas ned under den långvariga tid som krävs för total fixering. Om tidsgränserna följs (t.ex. högst 36 timmar som nämns ovan) finns det dessutom en möjlighet att vävnadsprovet inte fixeras (bevaras) tillräckligt i sin helhet. Av denna anledning bör vävnader för fixering som är bredare än flera millimeter eller kanske en eller två centimeter dissekeras i tunnare segment för optimal fixering (Hewitt, et al., 2008). Institutioner kan ha olika protokoll för hur lång tid och volym fixeringsmedel som krävs för vävnadsprover av olika bredd, men i allmänhet bör förhållandet mellan volymen fixeringsmedel och volymen vävnad vara 10:1 (Klatt, 2016).

Dehydrering

Det andra steget i behandlingen av FFPE-prover är dehydrering. Eftersom paraffin är omblandbart med vatten måste allt vatten från formalinlösningen avlägsnas från vävnaden innan paraffin kan infiltrera den. En serie alkohollösningar (ofta etanol), som ofta börjar med 70 % och fortsätter till 100 % alkohol, kommer att användas för att avlägsna i stort sett allt vatten från vävnaden. För optimal uttorkning krävs att man använder nya lösningar eller ofta byter ut använda lösningar, eftersom alkoholen blir alltmer utspädd när den används. Det är också absolut nödvändigt att detta steg fullföljs helt och hållet (med tillräckligt med tid avsatt för detta steg) eftersom otillräcklig uttorkning kan leda till vävnadsnedbrytning (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Tömning

Då paraffin faktiskt inte heller är blandbart i alkoholer, är nästa steg att avlägsna alkoholen med en substans som är blandbar med paraffin. Detta steg kallas clearing, och xylen är det clearingmedel som oftast används (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Paraffininfiltration

Efter adekvat fixering, uttorkning och clearing kan vävnaden slutligen genomgå paraffinininfiltration (eller impregnering). Detta steg är inte heller standardiserat, och institutioner runt om i världen kan använda olika paraffiner och vaxblandningar med varierande sammansättning. Paraffiner har olika smältpunkter och texturer som påverkar det slutliga vävnadsblocket och dess egenskaper. I USA liksom i Västeuropa används normalt syntetiska paraffiner med låg smältpunkt (55°C-63°C) för bästa resultat. Latex, dimetylsulfoxid och egna ”mjukgörare” kan ingå i formuleringen för att ändra texturen och formbarheten hos det slutliga vävnadsprovet (Hewitt, et al., 2008).

Nationer från andra delar av världen införlivar ofta bivax i sina formuleringar för att förbättra formbarheten och sänka smältningstemperaturen hos de lågkvalitativa paraffiner som används. Bivax innehåller dock föroreningar som pollen och det försämrar kvaliteten på det slutliga provet. Högre smälttemperaturer ska undvikas eftersom de senare resulterar i minskad och otillräcklig deparaffinering av vävnadsprovet samt en minskning av mängden nukleinsyror som återvinns från vävnaden (Hewitt, et al., 2008).

Paraffininbäddning

Det sista steget i bearbetningen av FFPE-prover är inbäddning i paraffin. Vävnadsprovet som infiltrerats med paraffin omges av ett lager av paraffin. Man måste se till att vävnadsblocket orienteras korrekt i formen (”kassetten”) eftersom detta påverkar snittplanet när tunna snitt skärs av blocket med en mikrotom (Klatt, 2016). När paraffinhöljet har stelnat är FFPE-blocket redo för förvaring och förblir välbevarat i flera år, till och med upp till decennier (Hewitt, et al., 2008).

Sektionering

När vävnaden är inbäddad är den redo för sektionering på mikrotomet. Eftersom vävnaden inte alltid är helt platt mot framsidan av paraffinet måste histoteknikern vanligtvis ”vända sig in i blocket”. Vävnadsblocket placeras i mikrotomens blockhållare och samtidigt som han eller hon justerar blockhållarens vinkel så att så lite vävnad som möjligt går förlorad, vrider histoteknikern på handhjulet och förflyttar blocket uppåt och nedåt mot ett vasst blad. Blocket skärs tills en full representativ sektion av vävnaden finns längst fram på blocket. När vävnaden är framme läggs blocket på is för att svalna, vilket underlättar skärandet av tunna sektioner; för varmt paraffin skapar komprimerad vävnad med skrynkliga sektioner. När blocket har svalnat placeras det tillbaka i blockhållaren. Teknikern vrider återigen på handhjulet, denna gång i en långsam, jämn takt för att skapa på varandra följande tunna sektioner som fastnar vid varandra och bildar ett ”band”.” Bandet placeras i ett varmt vattenbad (temperaturen hålls strax under paraffinets smältpunkt) för att släta ut eventuella rynkor som har bildats. Teknikern placerar sedan ett objektglas i vattenbadet och ”skopar upp” den eller de valda sektionerna så att de fastnar på objektglaset.

Den vanligaste tjockleken på vävnadssektioner är mellan 3-5 mikrometer (eller förkortat mikrometer), vilket är tjockleken på en enskild cell. Objektglas med 3-5 mikrometer stora sektioner används normalt för färgning, oavsett om det är den vanliga Hematoxylin & Eosin (H&E)-färgningen, specialfärgningen eller den immunohistokemiska (IHC) färgningen. Forskare begär ofta ”lockar” i stället för tunna snitt på objektglas. Curls är tjockare sektioner (10 mikrometer eller mer) som läggs i Eppendorf-rör och används i allmänhet när RNA eller DNA måste extraheras från FFPE-proverna. Tjocka sektioner kan också läggas på objektglas i stället för på rör. Detta är optimalt när endast en del av vävnaden kommer att användas för extraktion. I detta fall skrapas vävnaden från objektglaset och läggs i ett rör. FFPE-prover som har sektionerats är strukturellt stabila, och om de behandlas och förvaras på rätt sätt kan de användas för mikroskopisk analys en tid efter sektioneringen, men om kemiska extraktioner ska utföras bör sektionerna i allmänhet användas så snart som möjligt efter sektioneringen för att förhindra oxidativ och biologisk nedbrytning av de exponerade målmolekylerna.

Söker du information om histologi och tillvaratagande av FFPE-block som representerar specifika indikationer? Kolla in vår resurssida om histologi. Lab-Ally är branschledande när det gäller efterlevnad av 45CFR46 och 21CFR11, etiskt anskaffade humana biospecifikationer, bioinformatik, hantering av vetenskapliga data med mera.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehydfixering. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Changes in Differential Gene Expression because of Warm Ischemia Time of Radical Prostatectomy Specimens. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Vävnadshantering och preparering av prover inom kirurgisk patologi: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehyd, formalin, paraformaldehyd och glutaraldehyd: Vad de är och vad de gör. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Hämtad från http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Formalinpigment (surt hematin) och besläktade pigment. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Vävnadsfixering och effekten av molekylära fixeringsmedel på färgningsförfaranden i efterföljande led. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Kemiska och fysikaliska grunder för rutinmässig formaldehydfixering. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Effekten av fixeringsmedel och vävnadsbearbetning på innehållet och integriteten hos nukleinsyror. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). DNA-extraktion från formalinfixerad och paraffininbäddad vävnad. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Vävnadsbearbetning. Mercer University School of Medicine, Savannah. Hämtad från http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Tillgänglig 28 december 2016

.