Deoxynukleotidtrifosfater (dNTP) är de viktigaste byggstenarna i nukleinsyramolekyler och är därför nödvändiga komponenter i PCR-blandningar, eftersom inget nytt (amplifierat) DNA kan genereras utan dem. De fyra enskilda deoxynukleotider som utgör en DNA-sekvens (dvs. deoxyadenosintrifosfat, dATP, deoxythymidintrifosfat, dTTP, deoxycytosintrifosfat, dCTP; och deoxyguanosintrifosfat, dGTP) tillsätts vanligen till PCR- och RT-PCR-blandningar i ekvimolära mängder, men om den DNA-målsekvens som skall PCR-amplifieras huvudsakligen består av dATP/dTTP (AT-förhållandet) eller huvudsakligen dGTP/dCTP (GC-förhållandet) kan molförhållandet mellan de dNTP:er som tillsätts till PCR-blandningen ändras för att ta hänsyn till denna obalans. dNTPs köps vanligen antingen individuellt eller som en (ekvimolär) blandning från kommersiella leverantörer (t.ex. Roche, Promega osv.) och är kemiskt stabila när de förvaras i svagt alkaliska vattenlösningar vid -20 °C. Det bör dock noteras att dNTPs är naturligt sura i lösning, varför arbets- och lagerlösningar kan behöva neutraliseras med alkaliska föreningar före långtidsförvaring. Neutraliserade dNTP-lösningar justeras normalt till 10 mM-stocklösningar genom spektrofotometri eller genom att tillsätta rätt volym sterilt vatten till den lyofiliserade produkten direkt efter den kemiska syntesen. Vid vissa PCR kan det vara fördelaktigt att använda höggradigt renade dNTPs av PCR-kvalitet (Roche) som innehåller mindre än 0,9 % deoxynukleotiddifosfater (dNDP), är >99 % rena och fria från kontaminanter som modifierade nukleotider och tetrapyrofosfat. Dessa (dyrare) dNTPs med hög renhet kan vara till hjälp för att framgångsrikt amplifiera PCR-DNA från preparat som innehåller ett mycket lågt antal kopior av mål-DNA.
I vissa PCR-tillämpningar och protokoll kan en av de fyra dNTP:erna ersättas med en analog dNTP, t.ex. inosin, 7-deaza-2′ -deoxyguanosin, eller en modifierad dNTP, t.ex. en biotin-, fluorofor- eller radioaktivt märkt dNTP. Sådana modifieringar gör det möjligt att utföra ytterligare efter-PCR-behandlingstillämpningar nedströms.