Citrobacter freundii fitness during bloodstream infection

Samling av Citrobacter BSI-isolat

Vid jämförelse med andra gramnegativa arter som regelbundet orsakar BSI finns det begränsad information om C. freundiis fysiologi i värdmiljön. I syfte att åtgärda denna brist samlade vi först in åtta isolat som tillhör C. freundii-komplexet från patienter med BSI inom University of Michigan Health System. Ribosomalt RNA-baserad fylogeni kan särskilja tre grupper av Citrobacter-arter, varav grupp I omfattar minst åtta arter och inkluderar C. freundii23,24. 16S rRNA-sekvenser och masspektrometribaserade identifieringsmetoder ger dock en begränsad fylogenetisk upplösning inom denna grupp av Citrobacter-arter. Därför bedömdes isolaten som användes i den här studien ytterligare med hjälp av en multilocussekvensanalys. Bland de åtta insamlade isolaten var sex stycken nära knutna till etablerade C. freundii-stammar (fig. 1) och hade en genomsnittlig nukleotididentitet på >98 % med typstammen ATCC 8090, vilket ligger över den typiskt accepterade gränsen för isolat av samma art på 95 %. Av de två återstående isolaten klustrade UMH17 närmast med Citrobacter pasteurii-typstammen CIP 55.13 och UMH18 med Citrobacter werkmanii-stammar.

C. freundii bakteremi

För att undersöka Citrobacters konditionskrav under BSI utvecklades en murin modell för bakteriemi baserad på tidigare arbete med andra enteriska arter25. Bland Citrobacter BSI-isolaten valdes stammarna UMH14 och UMH15 ut som kandidater för användning i den här studien. Isolat UMH14 uppvisade en mer konsekvent dosberoende kolonisering av mjälte och lever 24 timmar efter injektion i svansvenen (Fig. S1) och valdes ut för ytterligare karakterisering. Det var också nödvändigt att testa infektionsmodellen för potentiella flaskhalsar för kolonisering innan man bedömde bidraget från enskilda C. freundii-gener till fitness med hjälp av en stor samling transposonmutanter. En spontan nalidixinsyra-resistent mutant av UMH14 (UMH14Nal) isolerades och fastställdes ha likvärdig in vitro fitness under samodling med moderstammen i rikt medium (Fig. S2). För att fastställa om en diversifierad population av mutanter kunde etableras i blodomloppet utan stokastisk förlust av enskilda kloner blandades UMH14Nal- och UMH14-stammarna i olika proportioner och inokulerades i möss. Efter 24 timmar tolererades förhållanden på upp till 1:10 000 (UMH14Nal:UMH14) utan spontan förlust av den underrepresenterade stammen i mjälten (fig. S2), vilket tyder på att en enda mus skulle kunna hysa minst 10 000 unika transposonmutanter vid en total dos på 5 × 107 bakterier med hjälp av denna modell.

För att identifiera Citrobacter fitnessgener i bakteriemodellen injicerades fem pooler av slumpmässiga transposoninsertsmutanter som representerar >44 000 unika insättningsställen i möss och bakterier som koloniserade mjälten återfanns efter 24 timmar (fig. S3). Den relativa abundansen av enskilda transposonmutanter i inokulumet och mjälteutgångarna, som bestämdes med hjälp av höggenomströmningssekvensering, användes för att identifiera gener som bidrar till bakteriernas överlevnad i modellen. Totalt 177 transposonstörda gener gav en signifikant förlust av fitness och nio gener var förknippade med ökad bakteriell fitness när de muterades (fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (Data S1). En andra analys med denna datamängd identifierade 546 kromosomalt kodade putativa essentiella gener för vilka antalet läsningar i ingångspopulationen var betydligt lägre än förväntat baserat på tillgängliga TA-platser och bibliotekspopulationens storlek (logFC <-5,17) (Data S2). Med hjälp av denna modell för opportunistisk och systemisk infektion förväntades det att majoriteten av identifierade fitnessfaktorer skulle representera centrala fysiologiska processer snarare än prototypiska virulensfaktorer (t.ex. proteintoxiner eller adhesiner). Kategoriseringen av de 177 gener som var förknippade med betydande fitnessdefekter med hjälp av Clusters of Orthologous Groups (COG) återspeglade faktiskt övervikten av metaboliska vägar och cellulära underhållsfunktioner som krävs under C. freundii-bakteriemi (Fig. 2). Ungefär hälften av de identifierade fitnessgenerna passar i stort sett in i fem COG-kategorier som omfattar energiproduktion, aminosyrametabolism, DNA-replikation och reparation, translation samt cellväggs- och membranbiogenes.

Validering av enskilda fitnessgenmutanter

Bidraget från enskilda genprodukter till C. freundiis fitness bekräftades med oberoende deletion-insertionsmutationer som konstruerades i utvalda UMH14-gener (tabell 1). Alla konstruerade stammar som rapporteras här saknade grova replikationsdefekter som bestämdes genom tillväxt i rikt medium (fig. S4). För varje gen som anges i tabell 1 mättes lämpligheten genom att saminfektera enskilda mutanter med UMH14-moderstammen. Fem av de sju ursprungligen testade mutanterna uppvisade en statistiskt signifikant konkurrensnackdel i antingen mjälte eller lever (fig. 3A), vilket bekräftar resultaten av transposon-screeningen. Mutanten znuB valdes ut som en negativ kontroll för validering här eftersom resultaten av transposon-screeningen visade att ingen fitnessdefekt var förknippad med denna gen, trots bevis från andra bakteriearter som visar att zinktransportsystemet ZnuABC bidrar till infektion hos murin26,27,28. I konkurrens med UMH14 uppvisade znuB-mutanten ingen betydande fitnessdefekt, vilket stämmer överens med de förväntade resultaten. De intilliggande generna znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) och znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) i UMH14 gav också antingen ingen fitnessdefekt eller en minimal defekt när de muterades genom transposoninsättning (Data S1).

Mutation av tatC-genen, som kodar för en komponent i systemet för translokation av tvillingarginin, resulterade i den största förlusten av fitness bland alla testade mutanter (fig. 3). För att avgöra om den minskade fitnessen hos denna mutant kunde återställas genom genetisk komplementering introducerades plasmid pBBR1MCS-5 med den öppna läsramen för tatC i tatC-mutanten och den relativa fitnessen hos den resulterande stammen testades. TatC-mutanten uppvisade ursprungligen en 67-faldig fitnessdefekt i mjälten i konkurrens med vildtypstammen (fig. 3A), medan den kompletterade tatC-mutanten endast uppvisade en tvåfaldig fitnessdefekt under samma förhållanden (fig. 3B). På samma sätt var den kompletterade tatC-mutanten inte signifikant utkonkurrerad i levern jämfört med UMH14. Moderplasmidet pBBR1MCS-5 är känt för att bibehållas stabilt under infektion i avsaknad av selektion29 och in vitro-odling av C. freundii tatC-mutanten som bär på antingen pBBR1MCS-5 eller komplementeringsplasmidet tatC+ visade ingen märkbar förlust av plasmid under 24 timmar i avsaknad av selektion (fig. S5). Tillsammans fastställer dessa resultat bestämt kravet på TatC-funktion under Citrobacter-bakterieremi.

Konservering av fitnessgener bland Citrobacter-isolat

Under den här studien bestämdes den fullständiga genomsekvensen för varje Citrobacter-isolat och den förutspådda proteomen för varje stam jämfördes med UMH14 som en referens. Av de 4 666 förutspådda genprodukterna som kodas på UMH14-kromosomen är 3 742 bevarade med ≥95 % identitet mellan alla C. freundii-isolat i den här studien (fig. 4A). Antalet bevarade proteiner (≥95 % identitet) mellan alla stammar minskar till 2 545 när de predikterade proteomerna från UMH17 och UMH18 inkluderades, vilket stämmer överens med placeringen av dessa isolat utanför C. freundii-grenen genom multilocus-sekvensanalys (Fig. 1). Bevarandet av UMH14:s fitnessfaktorer var också högt, med 145 av de förutsagda 177 proteinerna bevarade vid ≥95 % aminosyraidentitet bland de åtta bakteriestammarna (fig. 4B), inklusive alla sju av de ursprungliga fitnessfaktorerna som valdes ut för validering (tabell 1 och fig. 3). Genom att ta bort UMH17 och UMH18 från övervägandet ökade antalet konserverade fitnessfaktorer till 162 (92 %). Dessa resultat tyder på en överlevnadsstrategi för Citrobacter under bakteriemi som till stor del är beroende av bevarade proteiner inom arten. Intressant nog var få fitnessfaktorer helt unika (<30% identitet) för UMH14 inom denna undergrupp av stammar. Ett anmärkningsvärt exempel är ett förmodat operon med tre gener (CUC46_23440-CUC46_23450) med observerade fitnessdefekter som varierar mellan 6 och 14 gånger. Alla tre öppna läsramar kodar för hypotetiska proteiner och bland dessa är det bara CUC46_23450 som förutspås koda för en konserverad domän med en tilldelad funktion (cd01713, fosfoadenosinfosfosulfatreduktas).

DNA-rekombinations- och reparationsvägar

Ett av målen med den här studien var att identifiera bevarade biologiska vägar som involverade flera fitnessfaktorer för bakteriemi. Enzymkomplexen RecBCD och RuvABC som är involverade i DNA-rekombination och reparation utgör ett sådant exempel. RecBCD-enzymet är aktivt på duplexa DNA-ändar och krävs för processerna homolog rekombination och rekombinationell DNA-reparation. I samband med dessa funktioner underlättar RuvABC-enzymet migration och upplösning av Holliday junction-grenar30,31. Transposoninsättning i antingen recB, recC eller recD resulterade i en 6-8-faldig minskning av fitness och på samma sätt resulterade störning av både ruvA och ruvC genom transposoninsättning i en >30-faldig förlust av fitness (Data S1). Viktigt är att ruvA-fitnessdefekten bekräftades genom konkurrensinfektion mot vildtypstammen med hjälp av en oberoende konstruerad mutant (fig. 3A). Inom de två multiproteinkomplexen var det bara RuvB som inte identifierades som en betydande fitnessfaktor i vårt dataset. Båda proteinkomplexen är kända för att delta i upplösningen av avstannade eller kollapsade DNA-replikeringsgafflar som uppstår under normal kromosomsyntes30, även om det är viktigt att ruvA-mutanten växte på samma sätt som vildtypstammen under snabb replikation i rikt medium (fig. S4). Det är frestande att spekulera i att bakteriell DNA-skada som uppstår i värdmiljön, potentiellt genom immuncellsmedierad produktion av reaktiva syrearter, också kan bidra till kravet på dessa komplex.

Det dubbla arginintranslokationssystemet

Det dubbla arginintranslokationssystemet fungerar i gramnegativa bakteriearter för att utsöndra veckade proteiner över cytoplasmimembranet. TatC:s roll i detta bevarade multiproteinsystem är att känna igen signalsekvenser för sekretion av proteiner som exporteras genom denna väg. Efter att ha fastställt att tatC-genen har en betydande inverkan på C. freundiis in vivo-förmåga (fig. 3), drogs slutsatsen att de proteiner som utsöndras av Tat-systemet också kan vara nödvändiga för förmågan att klara sig i murinmodellen. För att identifiera tänkbara Tat-sekreterade proteiner analyserades den N-terminala sekvensen för var och en av de 177 fitnessfaktorerna med hjälp av prediktionsprogramvaran TatP 1.032 . Två gener, CUC46_16565 och CUC46_16060, identifierades som kodande för Tat-beroende signalpeptider som innehåller dubbla argininmotiv. Produkten CUC46_16565 har 94 % aminosyraidentitet med E. coli SufI-proteinet, inklusive 100 % bevarande av det dubbla argininmotivet och den hydrofoba delen av signalpeptiden33. C. freundii sufI-genen muterades och fitness bedömdes i konkurrens med UMH14-moderstammen för att avgöra om någon del av fitnessdefekten i samband med förlusten av TatC kunde tillskrivas störningen av SufI-funktionen (fig. 5A). Den muterade sufI-stammen konkurrerades faktiskt ut 7 gånger i mjälten och 17 gånger i levern jämfört med vildtypstammen. Eftersom fitnesskostnaden för tatC-mutationen varierade från 67-faldigt till 112-faldigt i konkurrens med vildtypbakterier (fig. 3), innebär den jämförelsevis låga fitnesskostnaden för sufI-mutationen att ytterligare Tat-beroende substrat också kan bidra till fitness. Försöken att etablera Tat-beroende sekretion av SufI i C. freundii misslyckades på grund av uppenbara toxicitetsproblem i samband med uttrycket av en C-terminal FLAG epitiop-märkt SufI-konstruktion, särskilt inom tatC-mutantstammen (data visas inte). SufI har dock använts som en modell för Tat-sekreterat protein i många studier som karakteriserar E. coli Tat-systemet.

Den andra potentiella tat-sekreterade fitnessfaktorn som identifierades, som kodas av CUC496_16060, är ett förutspått prolinaminopeptidas (PRK10879) som tillhör PepP-superfamiljen. En mutantstam som saknade pepP-genen utkonkurrerades ca 3 gånger i mjälten och ca 2 gånger i levern, men den observerade fitnessnackdelen jämfört med vildtypen var inte statistiskt signifikant (fig. 5A). Trots detta bestämdes PepP:s subcellulära lokalisering med hjälp av ett C-terminalt FLAG-epitopmärkt derivat som bars på en plasmid med flera kopior (PepPFLAG). Oväntat låga nivåer av PepPFLAG upptäcktes i tatC-mutanten jämfört med UMH14. PepPFLAG-fusionsproteinet hittades dock främst i den cytoplasmatiska fraktionen hos båda testade stammarna (Fig. S6) och inga bevis för Tat-beroende subcellulär lokalisering av PepP-proteinet erhölls. Tillsammans med resultaten från sufI-mutantens konkurrensinfektion stöder dessa data ytterligare uppfattningen att ytterligare Tat-beroende fitnessfaktorer finns i C. freundii eller att den kumulativa förlusten av proteintranslokation via Tat-systemet väger tyngre än funktionsförlusten för ett enskilt substrat.

En av de förhärskande fenotyperna som förknippas med förlust av tat-mutanter med förlust av funktion hos olika arter är en försämrad motilitet34,35,36,37. C. freundii är en flagelliserad bakterie som kan simma i en mjuk agarmatris. C. freundii tatC-mutanten uppvisade en ungefär 2-faldig minskning av simmotiliteten jämfört med vildtypstammen och simmotiliteten återställdes helt och hållet genom genetisk komplementering i trans (fig. 5B,C). Dessa resultat visar tydligt på en motilitetsdefekt i avsaknad av TatC-funktion, men eftersom simning på låg nivå fortfarande observerades i tatC-mutanten är det troligt att en viss flagellarfunktion bibehålls. Med undantag för fliQ tyder den allmänna bristen på flagella-associerade fitnessgener som identifierats under bakteriemi på att tatC:s betydelse för C. freundiis fitness till stor del kan vara oberoende av den flagelladysfunktion som observerats i denna stam.

Metaboliska fitnessvägar

Som tidigare nämnts förutspåddes en betydande del av de identifierade Citrobacter-fitnessgenerna att fungera i metaboliska vägar (fig. 2). Tre olika gener som representerar komponenter i den centrala kolmetabolismen (pfkA), fruktos- och mannosmetabolismen (mtlD) och aminosyrabiosyntesen (cysE) valdes ut för vidare undersökning. Bakteriell cysteinbiosyntes sker från L-serin genom intermediären O-acetyl-L-serin (OAS). Detta första steg i E. coli-modellvägen katalyseras av enzymet CysE O-acetyltransferas och förlust av cysE resulterar i en cystein auxotrofi38,39. En cysE-mutant av C. freundii kan inte heller replikera i ett definierat medium som saknar cystein (fig. 6A), men kan uppnå en täthet som ligger nära den vilda typen när mediet kompletterades med antingen OAS (fig. 6B) eller cystein (fig. 6C). Genetisk komplementering av cysE-mutationen resulterade i att tillväxten delvis återställdes i avsaknad av cystein. Intressant nog står den fullständiga avsaknaden av tillväxt för cysE-muterade bakterier i avsaknad av OAS eller cystein in vitro i kontrast till den partiella fitnessdefekt som observerades under infektion (fig. 3A). Detta tyder på att Citrobacter kan få tag på dessa metaboliter från blodomloppsmiljön, men att det fortfarande finns en fitnesskostnad förknippad med störning av biosyntesvägen.

Som en del av vår undersökning av den värdassocierade ämnesomsättningen hos Citrobacter undersöktes denna bakteries förmåga att utnyttja olika kolkällor. PfkA-enzymet fosfofruktokinas hos andra enteriska arter har karakteriserats i stor utsträckning och representerar det första engagerade steget i glykolysen och katalyserar fosforyleringen av fruktos-6-fosfat till fruktos-1,6-bisfosfat. För UMH14 eliminerade mutation av pfkA denna stams förmåga att replikera på glukos som enda kolkälla (fig. 6D), vilket delvis kunde återställas genom att tillhandahålla pfkA på en multikopierad plasmid. Denna totala förlust av glukosanvändning in vitro korrelerade med en tvåfaldig minskning av fitness under bakteriemi (Fig. 3A). Eftersom glukos är en riklig kolkälla i serum från däggdjur40 är dessa resultat förenliga med en roll för Citrobacter utnyttjande av glukos under infektion, men tyder också på att Citrobacter metaboliska repertoar kan underlätta utnyttjandet av alternativa kol- och energikällor.

En andra enzymatisk aktivitet som involverar fruktos-6-fosfat undersöktes också om den bidrog till Citrobacter bakteriemi. Proteinet mannitol-1-fosfat-5-dehydrogenas, MtlD, underlättar dubbelriktad omvandling av mannitol-1-fosfat och fruktos-6-fosfat med hjälp av NAD+ eller NADH som kofaktor41,42. Flera enteriska bakteriearter kan använda sockeralkoholen mannitol som enda kolkälla efter transport via ett hexitolfosfenolpyruvatberoende fosfotransferassystem, vilket resulterar i intracellulär ackumulering av mannitol-1-fosfat43,44. Ett möjligt öde för mannitol-1-fosfat är MtlD-beroende oxidation till fruktos-6-fosfat och efterföljande transport till den glykolytiska vägen. C. freundii mtlD-mutanten uppvisade en femfaldigt minskad fitness i murinleveren (Fig. 3A) och denna observation föranledde experiment för att avgöra om C. freundii kunde utföra denna typ av metabolism in vitro. UMH14- och mtlD-derivatstammar odlades i definierat medium som innehöll mannitol och de resulterande tillväxtkurvorna visar att vildtypbakterier och den kompletterade mutanten kunde föröka sig under dessa förhållanden medan mtlD-stammen inte kunde det (fig. 6E). Som förväntat kunde mtlD-mutanten föröka sig till nära vildtypnivåer när den fick glukos som kolkälla under aeroba förhållanden (fig. 6F). Tillsammans fastställer dessa resultat både C. freundiis förmåga att utnyttja mannitol som enda kolkälla och kravet på mtlD i denna process.

Gemensamma fitnessstrategier mellan patogener i blodomloppsmiljön

Vi har tidigare utvärderat fitnesskraven hos en annan opportunistisk patogen, S. marcescens, med hjälp av en liknande murin modell av bakteriemi. Resultaten av S. marcescens-studien omfattade identifiering av 212 fitnessgener med hjälp av tekniker som liknar det nuvarande arbetet45. I ett försök att fastställa om dessa arter har några gemensamma vägar för fitness under BSI jämfördes först de båda arternas predikterade proteomer. Proteiner betraktades som homologer mellan C. freundii och S. marcescens om de delade ≥70 % aminosyraidentitet över ≥50 % av sekvensen. Totalt identifierades 42 homologa proteiner som betydande fitnessfaktorer i båda organismerna (tabell S1) med ett antal olika funktioner är representerade i denna lista över gemensamma fitnessfaktorer. Särskilt RuvA-proteinet, vars förlust resulterade i en >10-faldig minskning av C. freundiis fitness genom konkurrensinfektion (Fig. 3A), identifierades tillsammans med RuvC som fitnessfaktorer i S. marcescens. Dessa resultat stöder ytterligare hypotesen att upplösningen av Holliday junction-komplex, eventuellt under rekombinationsreparation av DNA-skador, är viktig för in vivo fitness hos dessa organismer. Enzymet PfkA phosphofruktokinas identifierades också som en fitnessfaktor hos båda arterna. Liksom för Citrobacter krävs pfkA för S. marcescens för användning av glukos som enda kolkälla och för optimal bakteriell replikation i värmeinaktiverat humant serum45. I båda organismerna bidrog pfkA till fitness i mjälten enligt bedömningen i transposon-screeningen, men intressant nog uppvisade S. marcescens pfkA-mutanten också ca 9-faldigt minskad fitness i njuren genom konkurrensinfektion med vildtypstammen. Under detta arbete observerades att C. freundii UMH14 vildtypstammen uppvisade relativt dålig kolonisering av njuren i BSI-modellen, men pfkA-genen hos Proteus mirabilis har visat sig bidra till fitness i njuren efter urinvägsinfektion46. Tillsammans visar dessa resultat att det är möjligt att identifiera bevarade fitnessstrategier mellan organismer i en specifik miljö. Ytterligare arbete kommer att krävas för att fastställa om dessa genprodukter också krävs i ytterligare BSI-orsakande organismer och om dessa bevarade fitnessvägar kan utnyttjas.