Den 4 december besökte jag Clinic for Special Children i hjärtat av Pennsylvanias holländska landsbygd, där en liten personalstyrka tar hand om mer än 2 000 patienter med en rad olika ärftliga sjukdomar. I förra veckans inlägg beskrevs en familj där 5 av 6 barn har en anfallssjukdom med autistiska drag. Undersökningen av detta syndrom under de senaste 15 åren illustrerar på ett vackert sätt utvecklingen av metoderna för genupptäckt innan sekvensering katapulterade oss in i en ny teknisk tidsålder. (Varning: jargong på gång.)
Koppling av fenotyp till genotyp
För att identifiera genen bakom en odiagnostiserad sjukdom hos ett barn jämför forskarna i dag exomsekvenser (den proteinkodande delen av ett genom) från föräldrar och eventuellt syskon för att identifiera orsakande genvarianter (alleler). Det går snabbt.
Under tiden före arvsmassan följde forskarna en indirekt väg från fenotyp till genotyp:
– De konstaterade att symtom ”finns i familjer”.
– De fann att sjukdomen var vanligare bland enäggstvillingar än bland tvåäggstvillingar och bland syskon till patienter än i den allmänna befolkningen.
– De identifierade onormala kromosomer hos personer med sjukdomen.
– Användning av genombredda associationsstudier (GWAS) för att identifiera mönster av genetisk variation (vid uppsättningar av enstaka basplatser som kallas för enstaka nukleotidpolymorfismer, eller SNP) som skulle kunna flagga för en sjukdomsframkallande variant.
– Identifiering av genen och tillverkning av en musmodell för att testa behandlingar.
När amishfolket lämnade Schweiz i början av 1700-talet för att undkomma religiös förföljelse och bosatte sig i Pennsylvania tog de med sig en provtagning av den europeiska arvsmassan. Genom att föröka sig sinsemellan förstärktes mutationer och resulterade i ”körningar av autozygositet” i deras genom – avsnitt av kromosomer som har samma DNA-sekvenser på båda kopiorna. Autozygositetssträckor tyder på att två släktingar har ärvt en uppsättning genvarianter från en gemensam förfader, t.ex. kusiner från en gammelmorfar eller kusiner från en gammelmorfar. Dessa alleler, som kallas ”identiska genom härstamning” (IDB), är ett kraftfullt verktyg för genupptäckt om de endast förekommer hos personer som har samma sjukdom.
Den amiska kopplingen
Den pojke som jag träffade på kliniken och fyra av hans fem syskon har kortikal dysplasi-fokal epilepsi (CDFE) syndromet. Det beror på en enda saknad DNA-bas i en gen som kallas CNTNAP2.
Likt många berättelser om genupptäckter började upptäckten att mutationer i CNTNAP2 ligger bakom en rad olika hjärnsjukdomar – autism, kramper, schizofreni, Tourettes syndrom och språkstörningar – med olika trådar. Låt oss fokusera på sambandet med autism.
Även de äldsta genetiska metoderna visar att autism har en ärftlig komponent. Enäggstvillingar har mycket större sannolikhet att båda har det än tvåäggstvillingar; syskon till ett barn med autism har en risk som är 75 gånger större än hos befolkningen i allmänhet.
I 1998 använde International Molecular Genetic Study of Autism Consortium GWAS för att identifiera sex regioner i genomet som följde med personer som har autism – den främsta utmanaren fanns på den långa armen av den sjunde största kromosomen, eller ”7q”.
1999 involverade forskare CASPR2, en typ av protein som kallas neurexin och som, när det är onormalt, stör sändningen av en nervimpuls. Neurexiner ansluter sig till andra proteiner som kallas neuroliginer för att skapa de synapser som bildas när ett litet barn börjar utforska världen och konsoliderar minnet till inlärning.
I 2003 kom rapporter om omarrangerade kromosomer som stör genen som kodar för CASPR2, CNTNAP2, hos personer med Tourettes syndrom och 2007 hos personer som har intellektuell funktionsnedsättning, utvecklingsförsening, nedsatt talförmåga och hyperaktivitet, men inte Tourettes syndrom. Dessa olika tillstånd är inte förvånande – effekterna varierar beroende på var i hjärnan neurexinnivåerna är obalanserade.
År 2006 matchade forskare vid Clinic For Special Children och Translational Genomics Research Institute en mutation i CNTNAP2 med CDFE-syndromet hos närbesläktade Amish-barn. Anfallen börjar ungefär vid den ålder då autistiska drag tenderar att visa sig – 14 till 20 månader.
Innan anfallen börjar är symtomen på CDFE subtila: mindre motoriska förseningar, dåliga djupa tendonreflexer och något stora huvuden. Barnen har svårt att koncentrera sig, imitera människor och planera rörelser, t.ex. krypa, kryssa och gå. Anfallen är frekventa och allvarliga, och när de börjar förebådar de en avtagande utveckling av språkliga, kognitiva och sociala färdigheter. Efter flera år upphör anfallen, men intellektet stannar kvar i barndomen och individen behöver livslång vård.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, och Holmes Morton, MD, från kliniken och deras kollegor använde 100 000-SNP-mikroarray-enheter för att analysera DNA:t från fyra barn med CDFE-syndromet från tre Amish-familjer. De hittade en autozygot region som är 7,1 miljoner baser lång på det misstänkta området på 7q. (Dagens algoritmer upptäcker snabbt autozygositet i exomsekvenser.)
De 7,1 miljoner baserna innefattar 83 gener, men endast ett fåtal var meningsfulla. Teamet sekvenserade först en gen som kallas CENTG3 och som är känd för att orsaka andra hjärnsjukdomar. Men de sjuka barnen hade inga mutationer i den.
Då hittade dr Puffenberger, genetikern i teamet, en genväg: han lade märke till en SNP i mitten av CENTG3 som var heterozygot hos två barn (två olika varianter), i stället för homozygot (samma variant i båda kromosomkopiorna), vilket markerade ett slut på regionen med identiska genom härstamning. ”En rekombinationshändelse i mitten av genen gjorde det möjligt för Eric att göra sig av med mycket för att hitta mutationen. Det är ett perfekt exempel på ’slumpen gynnar det förberedda sinnet'”, berättade dr Morton. Denna upptäckt minskade den intressanta regionen på 7q till 3,8 miljoner baser.
Den andra kandidatgenen, CNTNAP2, ligger på gränsen till den intressanta regionen. Varje barn saknade en enda bas i båda kopiorna av kromosom 7 där, och varje förälder hade samma mutation, men i bara en kopia. De är bärare. Det var Mendels första lag som gällde.
Teamet hade hittat sin gen. De tittade sedan vidare i samhället, och bland 105 friska amish-personer var fyra bärare. Nio av 18 patienter som hade partiella anfall men ingen specifik diagnos, från 7 familjer, hade CDFE-syndromet.
Anfallen var förbryllande. ”En mutation kan orsaka olika typer av anfall. Fyra barn i en familj reagerar olika. Vissa är mycket handikappade, andra inte särskilt påverkade”, säger dr Morton. Tre barn opererades för att lindra anfallen, men lindringen varade inte länge. Operationerna gav dock prover av hjärnvävnad som gjorde det möjligt för forskarna att bättre beskriva vad som gick fel.
Konnektiviteten i de anfallsbenägna hjärnorna är en enda röra. Gränserna mellan grå substans och vit substans suddas ut, och vissa delar av hjärnbarken är förtjockade. Neuronerna i sig är inte helt rätt. De är för runda, för tätt packade och har störda dendritiska träd. Prickar på neuronerna tyder på för många kärnor från glia, de stödjeceller som utgör större delen av nervsystemet. Forskningsrapporten från 2006 var poetisk och beskrev amygdala, känslornas säte, i de epileptiska hjärnorna som ”excentriska mikroskopiska öar av delvis mogna neuronala föregångare i täta kluster”, täckta av glia som löper amok.
Porträttet av den amish epileptiska hjärnan var meningsfullt i ljuset av arbetet med neurexinproteinet CASPR2 (som står för contactin-associated protein-like 2). Neurexinet bildar en ställning vid Ranvierknutarna. Noderna är de utsatta platserna på en axon mellan kuddar av myelin, det isolerande materialet som i själva verket är cellmembranen från glia som är lindade runt neuronen som ett plåster runt ett finger. Nervimpulserna rusar genom noderna och skickar meddelanden tillräckligt snabbt för att upprätthålla livet.
Caspr2-proteinerna hos Amish-barnen är hämmade. De korsar inte neuronernas cellmembran och dyker inte ner i cytoplasman som de borde, vilket leder till att närliggande kaliumkanaler kollapsar. Dessa kanaler gör det normalt möjligt för kaliumjoner att rusa ut ur nervcellerna när en impuls passerar, vilket återställer den. Så utan neurexin-ställningar kan neuronen inte återställa sig själv. Överföringen avstannar. Och på något sätt börjar anfallen. Jag tror inte att man vet om anfallen framkallar de autistiska dragen eller om de uppstår direkt – ytterligare genetiska studier bör visa det.
En musmodell
Daniel Geschwind, MD, PhD och professor i neurologi vid David Geffen School of Medicine vid UCLA, arbetade med gener för autism och läste artikeln från 2006 i New England Journal of Medicine. ”Han ringde och sa: ’Du har hittat min gen!’. Ett trevligt samarbete inleddes, och han tillverkade en mus med Amish-mutationen”, säger dr Morton. Mössen har CNTNAP2-genen utslagen, och precis som människor har de anfall och autistiska drag.
”En mus springer vanligtvis runt i buren, normalt social och pratar. Dessa möss var ingetdera”, förklarade doktor Morton. Mössen uppvisade också repetitiva beteenden och hade kramper.
Hjärnorna hos de muterade mössen visade ett onormalt konnektivitetsmönster som påminde om det tidigare histologiska arbetet. ”Den främre delen av hjärnan pratar mest med sig själv. Den kommunicerar inte lika mycket med andra delar av hjärnan och saknar långväga förbindelser med bakre delen av hjärnan”, säger Dr Geschwind. Gruppen hade visat liknande avvikelser i hjärnan hos barn med autism.
Den slående likheten mellan amishbarnen och mössen ger en testplats för läkemedel. Risperidon, som skrivs ut för att behandla repetitiva beteenden hos barn, hade samma effekt på mössen, samtidigt som det förbättrade deras förmåga att bygga bo. Men läkemedlet hjälper inte barnen att umgås.
En uppenbar kandidat till läkemedel för att förbättra sociala färdigheter är ”kärlekshormonet” oxytocin. Det finns rikligt i samma hjärnneuroner som är rika på CASPR2-protein. Kan för lite oxytocin orsaka autistiska drag? Resultaten av tillskott av oxytocin är lovande, både hos möss och barn.
Dr Geschwind och medarbetare fann att en nässpray av oxytocin ”dramatiskt förbättrar sociala brister” hos mössen. Eftersom icke-autistiska möss inte reagerade verkar hormonet verkligen kompensera för ett underskott.
Amiska bönder ger redan oxytocin till kor för att kontrahera deras livmodermuskler, och jag minns att jag fick det för att få fart på ett avstannat arbete. Men försök inte med detta hemma. Flera kliniska försök pågår med oxytocin eller läkemedel som ökar dess aktivitet i hjärnan för att förbättra socialiseringen hos barn med autism.
Autism Speaks finansierade den första kliniska prövningen av oxytocin 2010, och NIH sponsrar en större pågående prövning av oxytocin nässpray. Men såvitt jag kan se, rekryterades patienterna baserat på kliniska diagnoser enligt DSM-IV – inte det mer specifika kriteriet genotyp.
Och även om idén om att prova oxytocin för att förbättra sociala symtom vid autism inte krävde att man kände till den underliggande mutationen, kan sådan information ge precision till alla slutsatser genom att man tar hänsyn till mekanismen – vilket kan leda till att man kan utveckla andra behandlingar. I ett annat inlägg kommer jag att titta på hur genetisk precision gjorde det möjligt för dr Morton att utveckla botemedel mot vissa medfödda fel i ämnesomsättningen som är mycket vanligare bland amishfolket, men som ändå dyker upp på alla nyföddas screeningsbilder.