Albers-Schönbergs sjukdom (autosomal dominant osteopetros, typ II) beror på mutationer i kloridkanalgenen ClCN7

Abstract

Albers-Schönbergs sjukdom, eller autosomal dominant osteopetros, typ II (ADO II), är den vanligaste formen av osteopetros, en grupp tillstånd som kännetecknas av en ökad skelettmassa på grund av försämrad ben- och broskresorption. Efter att genen som orsakar ADO II tilldelats kromosom 16p13.3 rapporterar vi nu sju olika mutationer i genen som kodar för kloridkanalen ClCN7 i alla 12 analyserade ADO II-familjer. Dessutom identifierades en patient med den allvarliga, autosomalt recessiva, infantila formen av osteopetros (ARO) som homozygot för en ClCN7-mutation. Utifrån genotyp-fenotypkorrelationer verkar det som om ADO II återspeglar en dominant negativ effekt, medan funktionsförlustmutationer i ClCN7 inte orsakar abnormiteter hos heterozygota individer. Eftersom vissa ARO-patienter har mutationer i båda kopiorna av ClCN7-genen är ADO II allelisk med en undergrupp av ARO-fall.

Received October 2, 2001; Revised and Accepted October 11, 2001.

INLEDNING

I hälsa är benvävnadsremodellering ett resultat av de balanserade processerna för benbildning och resorption. Överdriven resorption orsakar osteoporos, som står för de flesta icke-traumatiska frakturer (1). Omvänt orsakar defekt benresorption osteopetros som kännetecknas av täta men vanligtvis bräckliga ben. Minst åtta typer av osteopetros har beskrivits hos människor (2). Brist på isoenzymet kolsyraanhydrase II orsakar autosomalt recessiv osteopetros (ARO) med renal tubulär acidos och cerebrala förkalkningar (3; MIM 259730), medan majoriteten av fallen av malign ARO (4; MIM 259700) återspeglar mutationer i TCIRG1-genen (5,6). Vissa sällsynta fall av osteopetros, som uppenbarligen har ett autosomalt recessivt arvssätt, uppvisar en mildare fenotyp och kallas därför den ”intermediära” formen (7,8; MIM 259710).

Autosomal dominant osteopetros (ADO) är mycket vanligare än dess recessiva motsvarigheter (9). På grund av dess relativt godartade kliniska bild, där många patienter är asymtomatiska och endast upptäcks genom en tillfällig röntgenundersökning, underskattas dock prevalensen av ADO. Bland familjer med ADO rapporteras i allmänhet två subtyper som främst baseras på radiografiska kännetecken (10,11). Typ I (ADOI) kännetecknas av en generaliserad, diffus osteoskleros som särskilt drabbar kranievalvet (11). Typ II (ADO II; MIM 166600), den form som ursprungligen beskrevs 1904 av Albers-Schönberg (12), är den vanligaste formen med en uppskattad prevalens på upp till 5,5/100 000 (13). Kliniska manifestationer inkluderar icke-traumatiska frakturer, särskilt av långa ben, kranialnervspalier, artros i höften och mandibulär osteomyelit (14). ADO II manifesteras radiografiskt med en segmentär osteoskleros, främst vid de vertebrala ändplattorna (”rugger jersey spine”), iliac wings (”bone within bone”-tecken) och skallbasen (9) (Fig. 1).

Nyligen ledde en genomgripande sökning till att vi tilldelade en gen som ligger till grund för ADO II till kromosom 16p13.3 (15). Intressant nog finns genen som kodar för kloridkanalen ClCN7 inom kandidatregionen på 8,4 cM (16). Kloridkanalen är faktiskt viktig för försurningen av den extracellulära resorptionsklaffen som är nödvändig för den osteoklastmedierade nedbrytningen av benvävnad (17), och den är muterad hos en patient med ARO (17). Därför betraktade vi ClCN7 både som en positionell och funktionell kandidatgen för att orsaka Albers-Schönbergs sjukdom.

RESULTAT

Mutationsanalys av ADO II-familjer

Då den genomiska sekvensen, inklusive ClCN7-genen, finns tillgänglig i sekvensdatabaser (GenBank accession nos AL031600 och AL031705), är det möjligt att göra mutationsanalyser av exonerna och intron-exongränserna med hjälp av genomiskt DNA. Detta arbete avslöjade sju distinkta mutationer i ClCN7 (fig. 2) i 12 orelaterade ADO II-familjer (tabell 1). Fem mutationer är missense, en resulterar i en deletion av en aminosyra och en tar bort två nukleotider som orsakar en ramförskjutning som påverkar proteinets C-terminala ände. Ingen av dessa mutationer hittades i 100 kontrollkromosomer.

Fyra mutationer är redundanta mutationer. Mutationen 2423delAG identifierades i en familj från Frankrike och i en amerikansk familj. G215R-mutationen förekom i en fransk, en dansk och en amerikansk familj. P249L-mutationen hittades i en fransk och en tysk familj. Slutligen identifierades R767W-mutationen i en fransk och en amerikansk familj (tabell 1). De studerade familjernas olika geografiska ursprung, liksom analysen av mikrosatellitmarkörer som flankerar ClCN7-genen (data som inte visas), tyder på att det rör sig om oberoende mutationer, dvs. att de inte ärvs från en gemensam förfader.

Mutationsanalys av en ARO-patient

Länkningsanalys med markörer från kromosom 16p13.3 visade tydligt homozygositet för alla markörer hos en ARO-patient född av blodsbandsrika, friska föräldrar (data visas inte). Därför utfördes en mutationsanalys av ClCN7 som visade på en homozygot missense-mutation i position 766 (L766P) (fig. 2). Båda föräldrarna är heterozygota för denna mutation.

Position och bevarande av muterade aminosyror

Den transmembran-topologi som föreslagits för ClC-kloridkanalerna föreslår 10-12 transmembran-domäner (18). De fem aminosyror som är inblandade i missense ADO II-mutationerna, liksom den mutation som är inblandad i ARO-patienten, är alla mycket konserverade bland de olika medlemmarna i ClC-kloridkanalens genfamilj (fig. 3). G215R- och P249L-mutationerna är återkommande mutationer som hittats hos patienter i tre respektive två obesläktade familjer (tabell 1). G215 är en mycket konserverad rest som ligger mellan D2 och D3 (fig. 4), en region som är känd för att påverka kanalernas poregenskaper (19), medan P249 deltar i ett mycket konserverat, strukturellt element som utgör en väsentlig del av ClC-kanalens pore (20). R286 är belägen i det extracellulära utrymmet, strax utanför transmembrandomänen D5. Denna aminosyra är bevarad bland de olika ClC-proteinerna, med undantag för ClC1 och ClC2 som har en avvikande sekvens i denna region av proteinet. De två återstående ADO II-mutationerna och ARO-mutationen finns i den cytosoliska, C-terminala delen av proteinet och berör angränsande aminosyror. G765, L766 och R767 är belägna inom D13-sträckan, som sammanfaller med den andra CBS-domänen (cystathionin-β-syntas) som beskrivs i CLCN7-proteinet (21). Alla tre mutationer lokaliseras inom β2-strängen av CBS-domänen där mutationer har rapporterats orsaka sjukdom hos människor (22). Den exakta funktionen av denna domän är fortfarande oklar, men en roll i proteinsortering har föreslagits (21).

Slutligen involverar de två små deletionerna aminosyror från den intracellulära C-terminala delen av ClCN7. Aminosyran L688, som raderas hos en patient, är belägen mellan de två CBS-domänerna, medan deletionen av två nukleotider som börjar vid nukleotidposition 2423 resulterar, hos två obesläktade familjer, i ett protein som skiljer sig från ClCN7 av vildtyp endast i de sista 10 aminosyrorna.

DISKUSSION

Osteopetroser hos däggdjur utgör en heterogen grupp tillstånd som omfattar minst åtta olika kliniska enheter hos människor (2) och cirka nio spontana mutanter hos djur (23). Dessutom orsakar knockout-musmodeller för flera gener osteopetrotiska fenotyper, vilket illustrerar mångfalden av faktorer som är involverade i osteoklastdifferentiering och -aktivering (23).

Nyligen underströks heterogeniteten för humana osteopetroser av genetisk heterogenitet även inom ADO II-subtypen (24,25). Detta avslöjande baserades på en kopplingsstudie som omfattade en utvidgad dansk familj och som tilldelade ADO II-genen till kromosom 1p21 (26). Denna tilldelning bekräftades dock inte i studier av andra ADO II-familjer. I vår nyligen genomförda kopplingsstudie, som omfattade sex ADO II-familjer, lokaliserade vi den sjukdomsorsakande genen till kromosom 16p13.3 och fann i samma danska familj samregation mellan ADO II och en haplotyp på kromosom 16p13.3 (15). Därför spekulerade vi att bevisen för koppling till kromosom 1p21 i denna familj återspeglade tillfällig samregation. I den aktuella studien bekräftade vi denna hypotes genom att identifiera en sjukdomsorsakande mutation (G215R) i ClCN7-genen i denna danska familj. Detta, och det faktum att mutationer i denna gen hittades i alla 12 analyserade ADO II-familjer, tyder på att ADO II är genetiskt homogen.

Våra resultat illustrerar också att ADO II är allelisk med en undergrupp av patienter med den allvarliga, autosomalt recessiva, infantila formen av osteopetros. Tidigare har en ARO-patient beskrivits som en sammansatt heterozygot för en nonsense-mutation (Q555X) och en missense-mutation (R762Q) i ClCN7-genen (17). Vi finner nu en homozygot mutation (L766P) hos ytterligare en ARO-patient.

Figur 5 illustrerar vårt samband mellan de olika genotyperna och fenotyperna. Som framgår av fenotypen hos ClC-7 knockoutmusen orsakar fullständig funktionsförlust av kloridkanalen ClC-7 allvarlig osteopetros som ses hos ARO-patienter. Eftersom ClCN7-mutationer hittills endast har karakteriserats hos två ARO-patienter är det omöjligt att veta om eventuella fenotypiska skillnader återspeglar arten av deras mutationer. Vissa sällsynta fall av osteopetros har en ”intermediär” form. I dessa fall föreslås ett autosomalt recessivt arvssätt, men fenotypen är mildare än vid ARO (7,8). Kanske beror dessa fall på kombinationer av två mutationer i ClCN7 som var och en endast lindrigt minskar kapaciteten för Cl-ledningsförmåga.

De ADO II-mutationer som rapporterats här är huvudsakligen missense-mutationer som involverar konserverade aminosyror (figurerna 3 och 4). De två återstående mutationerna är små deletioner som också bevarar kloridkanalens huvudsakliga anatomi och därför sannolikt resulterar i effekter som är jämförbara med missense-mutationerna. Eftersom kloridkanaler verkar vara organiserade som multimerer, troligen dimerer (27), försämrar dessa mutationer troligen deras funktion på grund av dominerande negativa effekter. Med sådana effekter kommer de flesta kloridkanaler inte att fungera, vilket förklarar de fenotypiska avvikelserna.

I allmänhet är föräldrarna till ARO-patienter fenotypiskt normala. Vi antar att detta återspeglar det faktum att haploinsufficiens för denna gen med största sannolikhet inte orsakar kliniska komplikationer eller radiografiska fynd. Alternativt kan detta i vissa fall bero på den minskade penetransen av ADO II. Föräldrarna till den ARO-patient som presenteras i denna studie har inga kliniska symtom på ADO II, men en radiografisk undersökning var inte tillgänglig.

Den alleliska karaktären hos ADO II och ARO stöds i en rapport om en utvidgad familj med segregering av ADO II där en individ uppvisade ARO (28). Kanske orsakar i denna familj en muterad ClCN7-gen med dominant negativ effekt ADO II som sedan sammanfaller med en de novo-mutation, eller en mutation som ärvts från den andra föräldern som orsakar ARO. Den föreslagna förklaringen till både dominanta och recessiva former av osteopetros som är associerade med ClCN7-mutationer är parallell till mutationer i ClC-1-genen som orsakar myotoni. Mutationer som resulterar i förlust av ClC-1 orsakar den autosomala, recessiva formen (Beckertyp) (29) medan missense-mutationer manifesterar sig med den mindre allvarliga, autosomalt dominanta formen (Thomsen-typ) (30).

Sammanfattningsvis visar vi att de flesta, om inte alla, fall av ADO II orsakas av mutationer i ClCN7-genen. Baserat på ClCN7-mutationernas karaktär är ADO II-fenotypen troligen resultatet av en dominant negativ effekt. Våra resultat stöder hypotesen att kloridkanaler i allmänhet fungerar som homomultimers. Dessutom illustrerar vår studie den alleliska karaktären hos ADO II och en undergrupp av ARO-fall.

MATERIEL OCH METODER

Familjer och patienter

Familjerna A-F beskrevs tidigare eftersom de användes för att lokalisera genen för Albers-Schönbergs sjukdom på kromosom 16p13.3 (15). Proverna G-L är från drabbade individer från familjer med en historia av Albers-Schönbergs sjukdom och flera har också beskrivits (31-33) (tabell 1).

Familjen M bor i USA men är av kinesisk härkomst. Proposita är barn till ett friskt par och föddes efter en fullgången graviditet. Föräldrarna är kusiner i andra hand. ARO diagnostiserades vid 3 månaders ålder när hon kom till New York Hospital Medical Center of Queens med Bell’s palsy. Radiografisk skelettundersökning avslöjade allvarlig osteopetros och flera icke-placerade snedfrakturer. Hon hade anemi, retikulocytos, hepatosplenomegali och mild synnervsatrofi. Barnet genomgick en missanpassad allogen märgtransplantation men dog vid 18 månaders ålder av sepsis och andningssvikt.

Mutationsanalys

DNA isolerades från blod med standardprocedurer. Intronprimer (tabell 2), som amplifierar alla kodande exoner och intron-exongränser av ClCN7, utformades från genomiska sekvenser (GenBank accession nos AL031600 och AL031705). De 25 exonerna amplifierades från Genomic DNA Taq-polymeras eller med PCR enhancer system (Gibco BRL), med enhancer koncentration 1×. För alla amplifieringar utfördes 30 cykler vid en temperatur som anges i tabell 2.

PCR-produkterna renades med Concert Rapid PCR purification system (Life Technologies) och sekvenserades direkt med de primers som användes för amplifieringen, med hjälp av Big-Dye terminatorkemi (Perkin-Elmer) på en automatiserad sekvensator ABI 3100. Amplifiering av exon 9 resulterade i ett fragment av varierande längd eftersom detta exon följer en tandemrepetition av en sekvens på 50 bp med varierande antal kopior. I vår uppsättning prover varierade antalet kopior mellan fyra och sju upprepningar. Denna upprepning stör också i vissa prover sekvenseringen av detta exon i framåtriktad riktning.

Alla exoner där förmodade mutationer upptäcktes, sekvenserades i 100 kontrollkromosomer utan att mutationerna hittades.

ÅTERKÄNNANDE

Vi tackar patienterna och familjerna samt klinikerna som tillhandahöll material. Denna forskning stöddes av ett anslag (G.0404.00) från ”Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek” (FWO) till W.V.H. Denna forskning stöddes också av bidrag från ”Société Française de Rhumatologie” (SFR), ”Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris” (FERCMHP) och Shriners Hospital for Children (nr 8540).