Adenosine deaminase (ADA) är ett nyckelenzym i purinåtervinningsvägarna, och brist som orsakas av mutationer i ADA-genen resulterar i en av de vanligaste orsakerna till autosomalt recessivt svår kombinerad immunbrist (SCID), och står för cirka 10-15% av fallen i outbred populationer . Avsaknad eller nedsatt ADA-funktion leder till ackumulering av de toxiska metaboliterna adenosin, 2’deoxyadenosin och deoxyadenosintrifosfat (dATP). ADA-deficient SCID kännetecknas av allvarlig lymfocytopeni som påverkar T- och B-lymfocyter och NK-celler, men på grund av enzymets ubiquitära karaktär observeras även icke-immunologiska manifestationer, inklusive neurologiska utvecklingsstörningar, sensorineural dövhet och skelettmissbildningar. Incidensen av ADA-brist i Europa uppskattas till mellan 1:375 000 och 1:660 000 levande födda. Tidig diagnos av ADA-bristande SCID och inledande av behandling är avgörande för detta annars dödliga tillstånd. De nuvarande behandlingsalternativen omfattar enzymersättningsterapi (ERT), allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) och autolog genterapi (GT).
Biokemi
ADA är ett metaboliskt enzym som uttrycks överallt, även om nivån på enzymaktiviteten varierar, med de högsta nivåerna observerade i lymfoida vävnader, särskilt thymus, hjärnan och mag-tarmkanalen , och uttrycks både intracellulärt och på cellytan i komplex med CD26 . Tillsammans med purinnukleosidfosforylas utgör den en viktig komponent i purinåtervinningsvägen, som ansvarar för den irreversibla deaminering av adenosin och 2’deoxyadenosin till inosin respektive 2’deoxyinosin. Avsaknad eller nedsatt funktion resulterar följaktligen i både intracellulär och extracellulär ackumulering av dessa substrat. Adenosin kommer huvudsakligen från nedbrytning av adenosintrifosfat (ATP) och RNA, och 2’deoxyadenosin från nedbrytning av DNA. 2’deoxyadenosin hämmar irreversibelt enzymet S-adenosylhomocystein (SAH)-hydrolas, vilket leder till ackumulering av SAH, som sedan förhindrar S-adenosylmethionin-medierade metyleringsprocesser som krävs för normal tymocytdifferentiering, vilket troligen bidrar till den försämrade utvecklingen av T-lymfocyter som är uppenbar vid ADA-brist . Ökat intracellulärt upptag av 2’deoxyadenosin följt av fosforylering av deoxycytidinkinas leder till ackumulering av deoxyadenosintrifosfat (dATP) som hämmar ribonukleotidreduktas, vilket förhindrar normal DNA-syntes och reparation . Adenosin är en viktig extracellulär signalmolekyl, och störningar i dessa signalvägar tros kunna störa normala immunsvar . Adenosinreceptorer tillhör familjen G-proteinkopplade receptorer, av vilka det finns fyra subtyper (A1, A2A, A2B och A3), som spelar olika roller i regleringen av normal cellfysiologi i ett stort antal vävnader, bland annat i hjärnan, det kardiovaskulära systemet och lungorna .
Diagnos
Diagnosen av ADA-brist fastställs genom biokemiska och molekylärgenetiska tester. Biokemisk testning påvisar frånvarande eller kraftigt nedsatt ADA-aktivitet (< 1 % av det normala) och tydlig förhöjning av metaboliten dATP eller totala dAdo-nukleotider (summan av dAMP, dADP och dATP) i erytrocyter. Minskad aktivitet av SAH-hydrolas i erytrocyter (< 5 % av det normala) är också karakteristisk. Om en patient med misstänkt ADA-brist nyligen har fått en blodtransfusion kan analys av ADA-aktivitet mätas hos föräldrarna, med minskad aktivitet hos heterozygota bärare, eller utföras på icke-erytroida celler som leukocyter. Fibroblaster kan också användas, men fibroblastkulturer är vanligtvis inte lätt tillgängliga och detta kan fördröja diagnosen. Molekylärgenetisk diagnos bygger på identifiering av bi-alleliska patogena mutationer i ADA-genen, som ligger på kromosom 20q12-q13.11 och där över 70 orsakande mutationer har identifierats.
Understödjande laboratoriefynd inkluderar lymfocytopeni, med avsaknad av T- och B-lymfocyter och NK-celler, och lågt serumimmunoglobulin, även om IgG i tidig spädbarnsålder kan vara normalt på grund av materno-placental överföring. T-lymfocyternas proliferativa respons är låg eller saknas, liksom specifika antikroppssvar. Nivån av metaboliska substrat och genotypen har visat sig korrelera med den kliniska fenotypens svårighetsgrad .
Kliniska manifestationer
Immunsystem – effekter på cellulär nivå
De dominerande konsekvenserna av ADA-brist är på immunsystemet, vilket orsakar en allvarlig utarmning av T- och B-lymfocyter och NK-celler, vilket resulterar i en försämrad cellulär och humoral immunitet. Höga nivåer av ADA uttrycks i lymfoida vävnader på grund av den höga cellomsättningen, särskilt i thymus, vilket sannolikt förklarar de resulterande allvarliga lymfocytotoxiska effekterna av brist . De underliggande mekanismer som är ansvariga för de skadliga effekterna på immunsystemet har belysts med hjälp av experimentella modeller med ADA-brist. Det finns uttalade effekter på utvecklingen av tymocyter, även om det exakta skede i vilket detta sker är okänt. Apasov et al. påvisade omfattande apoptos i thymian hos ADA(-/-)-murinmodeller, men inte i de perifera lymfkörtlarna och mjälten, vilket visar att det finns en skadlig effekt på de thymocyter som utvecklas. Apoptos i tymus var tydlig främst vid den kortiko-medullära gränsen och påverkade särskilt dubbelpositiva tymocyter. Perifera T-lymfocyter var också onormala, med avvikande fördelning i sekundära lymfoida vävnader och uttryck av cellmarkörer samt defekt T-lymfocytsignalering genom TCR . Man tror att kombinationen av både intracellulär ackumulering av toxiska substrat och defekt T-lymfocytsignalering bidrar till utarmningen av de växande tymocyterna.
B-lymfocytkompartmentet påverkas också vid ADA-brist och patienterna uppvisar allvarlig B-lymfocytopeni och hypogammaglobulinemi, även om den tidiga B-lymfocytutvecklingen, i motsats till T-lymfocyterna, inte tycks vara störd. Man har observerat en onormal arkitektur i spleniska germinalcentra, vilket tyder på en försämrad antigenberoende mognad av B-lymfocyter, och B-lymfocyter uppvisar också en minskad proliferationsförmåga, ökad apoptos och försämrad signalering vid aktivering . Detta tyder på att B-lymfocytdefekten snarare är relaterad till försämrad differentiering på grund av en inneboende defekt än enbart på grund av brist på lämplig CD4+ T-lymfocythjälp. Försämrad V(D)J-rekombination på grund av ökade dATP-nivåer kan också påverka B-lymfocyternas mångfald och funktion negativt .
Immunsystem – kliniska manifestationer
Som ett resultat av en allvarligt defekt cellulär och humoral immunitet, inträffar den typiska presentationen av ADA-brist tidigt i livet med allvarliga infektioner och bristande tillväxt, och drabbade individer kommer normalt att duka under inom det första eller andra levnadsåret utan intervention. Den kliniska bilden av ADA-deficient SCID liknar andra genetiska former av SCID, med ihållande diarré, dermatit och allvarliga infektioner, ofta orsakade av opportunistiska patogener som Pneumocystis jiroveci, som kännetecken. Fysiska fynd är bl.a. avsaknad av thymuskörteln på thoraxradiografier och avsaknad av lymfoida vävnader.
Non-immunologiska manifestationer
Den allestädes närvarande karaktären hos ADA innebär också att konsekvenserna av brist inte är begränsade till lymfocyter, och många andra systemiska icke-immuna särdrag observeras också, med känd påverkan på nerv-, hörsel-, skelett-, lung-, lever- och njursystem samt kognitiva och beteendemässiga abnormiteter. Icke-immunologiska manifestationer har blivit tydligare under de senaste åren i takt med att överlevnaden och immunrekonstitutionen förbättras efter stamcellstransplantation, och medvetenhet och identifiering av involvering av flera organsystem är viktigt för att möjliggöra optimal hantering i rätt tid.
Barn med ADA-brist har visat sig uppvisa en rad beteendeavvikelser, inklusive uppmärksamhetsstörningar, hyperaktivitet, aggressivitet och sociala problem, som tycks utvecklas oberoende av de influenser som är förknippade med HSCT . IQ-nivåerna är lägre hos barn med ADA-brist i SCID jämfört med befolkningsgenomsnittet och jämfört med barn med andra former av SCID . Höga nivåer av ADA-uttryck som hittas i hjärnan , och upptäckten att de totala IQ-poängen korrelerar med nivån av dATP vid diagnosen , stöder ytterligare teorin att kognitiv försämring både är en konsekvens av den metaboliska störningen vid ADA-brist och är beroende av graden av brist.
Bilateral sensorineural hörselnedsättning rapporterades för första gången hos två patienter med ADA-brist som framgångsrikt hade behandlats med HSCT. Strukturella och infektiösa orsaker uteslöts och båda patienterna fick ingen konditionering före HSCT, vilket utesluter detta som en potentiell orsak och implicerar den underliggande metaboliska defekten . En hög prevalens av bilateral sensorineural hörselnedsättning (58 %) rapporterades i en kohort av 12 patienter med ADA-brist som hade behandlats med HSCT . I denna studie hittades inget samband mellan dövhet och dATP-nivåer.
Adenosindeaminas metaboliska roll och konsekvenserna av ackumulering av toxiska substrat i lungorna har påvisats i experimentella modeller, där ADA(-/-)-möss uppvisar allvarlig lunginflammation, med ackumulering av aktiverade makrofager och eosinofiler, och remodellering av luftvägarna, vilket är reversibelt vid initiering av ERT . Musmodeller har också visat att långvarig exponering för höga koncentrationer av adenosin i lungorna på grund av behandling med lågdos ERT leder till utveckling av lungfibros, men dessa förändringar vändes när man minskade de pulmonella adenosinnivåerna . Hos patienter med ADA-brist ses liknande lungmanifestationer, och icke-infektiös lungsjukdom, inklusive pneumonit och pulmonell alveolär proteinosis (PAP), förekommer oftare än i andra genetiska former av SCID . 43,8 % av patienterna med ADA-deficient SCID hade PAP i en studie som snabbt försvann (hos alla utom en patient) efter att ERT påbörjats .
Skeletala abnormiteter, som t.ex. involverar de costokondrala lederna, rapporteras ofta och är möjligen relaterade till en obalans mellan nukleär faktor-κB ligand (RANKL) och osteoprotegerin (OPG), vilket stör samspelet mellan osteoblaster och osteoklaster och den efterföljande benbildningen, även om abnormiteterna i huvudsak bara är synliga på radiologisk avbildning utan dysmorfiska konsekvenser . Effekten av toxiska metaboliter på benmärgen kan spela en roll i den ”autokonditionering” som är uppenbar hos ADA-deficienta SCID, med skapandet av stamcellsnischer som underlättar donatorns hematopoietiska stamcellsgraftning. Skelettmissbildningar har dock också rapporterats vid andra immunbrister och fullständig korrigering efter behandling ses inte, vilket tyder på att andra faktorer är inblandade i patogenesen.
Hepatisk inblandning vid ADA-brist tycks skilja sig åt mellan möss och människor. Murina ADA(-/-)-modeller uppvisar allvarlig hepatocellulär degeneration som är dödlig under den perinatala perioden . I jämförelse med detta ses normalt inte en allvarlig grad av leverpåverkan hos ADA-defekta patienter, även om det finns en fallrapport om en patient med ADA-defekt SCID som utvecklade en snabb dödlig leversvikt som inte kunde tillskrivas en infektion , och ett nyfött barn med ADA-defekt SCID med hepatit och hyperbilirubinemi som försvann med ERT . Rapporter om njurpåverkan vid ADA-brist omfattar förekomsten av mesangialskleros i 7/8 av obduktionerna av ADA-bristpatienter, där 6/8 också uppvisar kortikalskleros i binjurarna . Atypiskt hemolytiskt uremiskt syndrom rapporterades hos 4 patienter med ADA-brist, varav 2 återhämtade sig med lindrig eller ingen kvarstående njurfunktionsnedsättning efter stödjande behandling och inledande av ERT . Dermatofibrosarcoma protuberans är en sällsynt malign hudtumör som har rapporterats förekomma oftare hos patienter med ADA-brist, men mekanismen bakom detta är oklar .
Men även om ADA-brist i stor utsträckning accepteras som en systemisk metabolisk störning är det viktigt att ta hänsyn till att vissa systemiska manifestationer endast har rapporterats hos ett litet antal patienter. Andra bidragande faktorer, t.ex. infektionsmedel, kan vara inblandade och ytterligare undersökningar av den underliggande patogenesen för dessa manifestationer behövs. Icke desto mindre är medvetenhet om multiorgansammanbrott viktigt för optimal patientvård.
Partiell och sent insjuknande i ADA-brist
Det finns en heterogenitet i fenotypen av ADA-brist, där cirka 15-20 % av patienterna uppvisar ett ”fördröjt kliniskt insjuknande” och uppvisar mindre allvarlig, men gradvis förvärrad, kombinerad immunbrist senare i livet, vanligen inom det första decenniet, men ibland i vuxen ålder . De kliniska manifestationerna i denna grupp med ”försenad insjuknande” omfattar återkommande, men mindre allvarliga infektioner, som särskilt drabbar bihålorna och lungorna. Virusinfektioner med papillomvirus förekommer också. Autoimmunitet, allergi och förhöjda IgE-nivåer kan också förekomma. På grund av detta spektrum av kliniska fenotyper är det viktigt att överväga diagnosen ADA-brist hos äldre personer, eftersom fördröjd upptäckt leder till försämrad immunologisk funktion och utveckling av irreversibla följder av återkommande och kroniska infektioner. Vid screening har man också identifierat asymtomatiska personer som har mycket låg eller ingen ADA-aktivitet i erytrocyter, men högre ADA-aktivitet (2-50 % av det normala) i cellkärnor, s.k. partiell ADA-brist . Dessa patienter har till synes normal immunfunktion och förväntad livslängd, även om långtidsuppföljningsdata för närvarande inte finns tillgängliga för att bekräfta detta.
Hantering
Till skillnad från andra former av SCID innefattar hanteringen av ADA-brist flera alternativ; ERT, allogen HSCT och autolog GT, av vilka endast de två sistnämnda är botande.
ERT med polyetylenglykolkonjugerat adenosindeaminas (PEG-ADA) är det enda terapeutiska alternativet som inte är definitivt när det gäller korrigering av sjukdomen, men som möjliggör systemisk clearance eller ”avgiftning” av de toxiska metaboliska substraten. ERT är ett alternativ om det inte finns någon lämplig HSCT-donator eller om det finns kontraindikationer för HSCT, men långvarig ERT är förknippad med suboptimal immunrekonstitution . Andra begränsningar för ERT är bristande tillgänglighet i vissa länder, höga kostnader och det faktum att det krävs livslång behandling. Det är också ett kortsiktigt alternativ som används som en stabiliserande brygga till HSCT eller GT för att förbättra den endogena immunfunktionen och hjälpa till att återhämta sig från infektioner eller vid pulmonell alveolär proteinos för att optimera det kliniska tillståndet före slutgiltig behandling . Användning av ERT och tidpunkten för upphörande före allogen HSCT måste övervägas noggrant eftersom en förbättring av mottagarens immunitet innebär en potentiellt ökad risk för avstötning av transplantatet, men upphörande av ERT utsätter patienten för en avsevärt ökad risk för infektioner. Intressant nog visade Hassan et al. ingen skillnad i överlevnad mellan patienter som fick och inte fick ERT ≥ 3 månader före HSCT, men majoriteten av den grupp som fick ERT fortsatte med matchad obesläktad donator/missmatchad obesläktad donator (MUD/MMUD) eller haploidentiska donatortransplantationer . ERT kan fortsätta i en månad efter GT, eller fram till infusionstillfället, för att bibehålla låga nivåer av toxiska metaboliter för att underlätta inympning av de genkorrigerade cellerna .
Traditionsenligt har HSCT varit den bästa behandlingen för ADA-bristande SCID, och den utförs vanligen så snart som möjligt efter diagnosen för att minimera den tid som exponeras för höga nivåer av toxiska metaboliter och före förvärv av infektioner. I den hittills största studien som undersökt resultatet av 106 patienter med ADA-deficient SCID efter HSCT var tidigare HSCT förknippad med en bättre total överlevnad, men detta uppnådde inte statistisk signifikans, vilket möjligen berodde på ett mindre antal patienter i de äldre grupperna . Ett bättre övergripande resultat observeras efter HSCT med hjälp av matchade syskon- och familjedonatorer (MSD/MFD) jämfört med MUD- och haploidentiska donatorer (86 % och 81 % jämfört med 66 % respektive 43 %) . Detta kan ha att göra med att syskon- eller familjedonatorer snabbare blir tillgängliga, vilket sannolikt leder till ett bättre kliniskt tillstånd vid HSCT. MSD- och MFD-HSCT utförs också vanligtvis utan seroterapi, vilket har en positiv inverkan på graden av återhämtning av T-lymfocyter och eliminering av virusinfektioner hos dessa patienter. Utfallet är också betydligt bättre vid icke-konditionerad HSCT jämfört med myeloablativ konditionering, även om avsaknad av konditionering också kan försämra graftningen, särskilt med haploidentiska donatorer . Okonditionerad HSCT med användning av MSD eller MFD är förknippad med framgångsrik cellulär och humoral immunrekonstitution, även om det långsiktiga utfallet av immunstatus är okänt och ytterligare uppföljning är nödvändig . Detta står i motsats till andra former av SCID, och det kan vara så att de lokala toxiska effekterna av ADA-brist på märgen fungerar som ”autokonditionering” och gör det möjligt för donatorns stamcellsgraftning i avsaknad av kemoterapi. Patienter som överlever HSCT tycks klara sig bra när det gäller immunrekonstitution, oavsett vilken typ av donator som använts, och de flesta patienter uppnår fullständig cellulär och humoral återhämtning, kan göra vaccinsvar och behöver inte ersättas med immunglobulin . Däremot kan endast cirka 50 % av de patienter som får långvarig ERT avbryta immunglobulinersättningsbehandlingen.
Mindre än 25 % av patienterna med ADA-deficient SCID har en MSD eller MFD tillgänglig, och i sådana situationer har GT etablerat sig som ett accepterat terapeutiskt alternativ. Efter den inledande utvecklingen för mer än 20 år sedan har GT för ADA-deficient SCID blivit en milstolpe i det medicinska framåtskridandet som den första ex vivo-stamcellsretrovirala vektorn GT (Strimvelis™) med EU-licens från Europeiska unionen (EU) . Före utvecklingen av Strimvelis™ användes benmärg eller navelsträngsblod utan förberedande konditionering, men detta resulterade i otillräcklig ADA-produktion och patienterna behövde kontinuerlig ERT. Förbättrade metoder för genöverföring och införandet av icke-myeloablativ konditionering med låg dos busulfan före infusionen för att skapa utrymme för de transfekterade cellerna resulterade i en effektiv immunrekonstruktion och, hittills, inga rapporter om genotoxisk mutagenes, till skillnad från andra primära immunbrister som behandlas med genterapi med retrovirala vektorer . Den hittills största rapporten från Cicalese et al. om 18 ADA-SCID-patienter som behandlats med GT, med en medianuppföljning på 6,9 år, rapporterade en 100-procentig överlevnad utan leukemiska transformationer, minskad infektionsfrekvens och robust återskapande av T-lymfocyter och senare B-lymfocyter, även om procentandelen genkorrigerade myeloida celler var mycket lägre . Fördelarna med GT är bl.a. att det inte finns någon risk för transplantat mot värd-sjukdom och att behandlingen inleds snabbare än vad som krävs för att söka efter en donator när en MSD eller MFD inte är tillgänglig. Det långsiktiga resultatet är dock ännu inte känt och ytterligare övervakning krävs för att bättre förstå riskerna med GT jämfört med allogen HSCT eller långvarig ERT. Även om GT med hjälp av gamma-retrovirala vektorer hittills har uppvisat en utmärkt säkerhetsprofil har det nyligen rapporterats om nya utvecklingar med lentiviral vektormedierad GT, som utnyttjar potentialen att transducera både icke-delande och delande celler, och som uppvisar lovande resultat när det gäller både klinisk effekt och säkerhet .
Långsiktigt resultat
Transplantation med MSD eller MFD utan konditionering tidigt efter diagnosen är förknippad med ett gott resultat när det gäller överlevnad och CD3+ återhämtning under det första året efter HSCT , men det är lite känt om det långsiktiga resultatet och kvaliteten på immunrekonstruktionen hos patienter med ADA-deficient SCID. Utökad tillämpning av screening av nyfödda för SCID kan bidra till att förbättra resultaten ytterligare i framtiden genom att möjliggöra identifiering av spädbarn med SCID (av alla genetiska orsaker) innan infektioner och andra komplikationer utvecklas med hjälp av upptäckt av T-cellreceptor excision circles (TRECs). TRECs är bitar av DNA som skärs av under utvecklingen av T-cellsreceptorn och är ett exakt mått på thymusproduktionen. Patienter med SCID har ett avsevärt minskat antal TRECs som kan påvisas med hjälp av nyföddas torkade blodfläckar . En tidigare diagnos och en minskad börda av komplikationer gör det möjligt att ingripa snabbare och förbättra resultatet, eftersom studier visar att syskon som diagnostiseras på grundval av en känd familjehistoria har en betydligt bättre överlevnad . Trots de positiva utsikterna när det gäller immunrekonstitution efter HSCT enligt Hassan et al. var uppföljningsperioden i denna studie högst 27,6 år (median 6,5 år) , och det krävs längre uppföljningsdata för att fortsätta att utvärdera T-lymfocyt-immunitetens varaktighet, eftersom de första uppgifterna tyder på att thymopoiesis är begränsad i okonditionerade MFD/MSD HSCT:er, vilket kan leda till att T-lymfocytrepertoaren till slut uttöms . Utsikterna för GT som ett terapeutiskt alternativ är också lovande, särskilt med utvecklingen av förfinade vektorer och genredigeringsteknik, men ytterligare långsiktig uppföljning behövs. Utveckling sker också när det gäller att förbättra PEG-ADA, och en klinisk prövning pågår med användning av ett rekombinant enzym som ett alternativ till de sekvenser från nötkreatur som för närvarande används. Även om inga stora prospektiva studier har utförts för att undersöka resultatet av icke-immunologiska defekter efter definitiv behandling, tyder små retrospektiva rapporter på att neurologiska, beteendemässiga och audiologiska defekter inte korrigeras. Ytterligare studier behövs för att undersöka om faktorer som givartyp och konditionering eller typ av behandling påverkar resultaten på dessa områden. Det behövs också ytterligare förståelse för den underliggande patogenes som är involverad i de icke-immuna systemiska manifestationerna för att möjliggöra en optimal utredning och hantering samt för att fullt ut kunna skilja mellan de metaboliska effekterna av ADA-brist och effekter som orsakas av infektiösa agens.