Abstrakt
Xiao-Yao-San (XYS) odvar je tradiční čínská medicína. Cílem této studie bylo prozkoumat účinek XYS na kognitivní schopnosti a jeho základní mechanismus u ovariektomovaných potkanů. Samice potkanů kmene Sprague-Dawley byly ovariektomovány a léčeny odvarem XYS (3 g/kg nebo 9 g/kg) formou gaviálu, přičemž jako pozitivní kontrola léčiva byla použita subkutánní injekce 17-β estradiolu (E2, 2 μg/kg) a jako placebo kontrola byl podán 1 ml fyziologického roztoku (0,9 %). Po 6 týdnech léčby byli potkani vyšetřeni pomocí testu Morrisova vodního bludiště. Hladina estradiolu v séru a hipokampu byla měřena metodou ELISA. Pro pozorování morfologie neuronů v hipokampu bylo provedeno barvení Golgiho. Apoptóza hipokampálních buněk byla pozorována pomocí barvení TUNEL. Obsah proteinů N-methyl-D-aspartátového receptoru (NMDAR) 2A a 2B v hipokampální oblasti CA1 byl stanoven pomocí Western blotu a imunohistochemie. Exprese estrogenového receptoru (ER) a signalizace PI3K byla zjišťována pomocí Western blotu. Ve srovnání s falešnou skupinou bylo u ovariektomovaných potkanů zhoršeno učení i paměť. Potkani léčení E2 nebo vysokými dávkami XYS vykazovali lepší učení a paměť ve srovnání s potkany léčenými fyziologickým roztokem. Vysoká dávka XYS významně snížila latenci útěku v prostorovém akvizičním pokusu; mezitím se v prostorovém pokusu se sondou zvýšily křížové časy a doba trvání v kvadrantu sondy. Vysoká dávka XYS podporovala de novo syntézu obsahu E2 v hipokampu, ale neměla významný vliv na hladinu E2 v séru. Barvení Golgiho kanálků ukázalo, že vysoká dávka XYS může zvýšit počet větví a hustotu dendritických trnů v hipokampální oblasti CA1. Barvení TUNEL ukázalo, že vysoké dávky XYS zmírnily apoptózu neuronů vyvolanou ovariektomií. Úroveň exprese NMDAR2A a NMDAR2B v hipokampální CA1 byla léčbou XYS zvýšena. Příznivý účinek XYS byl způsoben aktivací signalizace ERα-PI3K. Závěrem lze říci, že léčba vysokými dávkami XYS může zlepšit kognitivní schopnosti ovariektomovaných potkanů ochranou hipokampálních neuronů a obnovením hladiny E2 v hipokampu.
1. Úvod
Ženy v perimenopauze často trpí úzkostí a depresí související s kolísáním hladiny estrogenu . Kromě úzkosti a deprese je další častou stížností žen v perimenopauze zapomnětlivost. Studie Seattle Midlife Women’s Health Study uvádí, že 60 % žen středního věku zaznamenalo zhoršení paměti . Studie SWAN (Study of Women’s Health Across the Nation) zjistila, že perimenopauza je u žen středního věku závislým rizikovým faktorem pro zapomnětlivost, kterou samy uvádějí . Protože mozek je důležitým cílem regulace estrogenů, spekuluje se, že za zhoršení kognitivních funkcí může být zodpovědný nedostatek estrogenů. Výsledky observačních studií o vlivu na poznávání však nejsou zcela konzistentní . Navíc účinné terapeutické hormonální zásahy ke zlepšení kognitivní výkonnosti dosud nebyly stanoveny . K příznakům paměti mohou navíc přispívat i další faktory, jako je vnímaný stres, nálada a fyzické zdraví . Produkce ovariálních estrogenů má na paměť větší vliv v případě náhlého poklesu než přirozeného přechodu . Na rozdíl od rozporů ve studiích na lidech podporují nálezy u ovariektomovaných zvířat souvislost nedostatku estrogenů s kognitivními změnami a účinnost hormonální substituční terapie .
Suplementace fytoestrogeny je oblíbenou alternativní terapií ke zmírnění příznaků menopauzy. Fytoestrogeny, jako jsou flavonoidy, isoflavony a lignany, mají strukturu podobnou steroidním estrogenům a mohou hrát roli podobnou estrogenům tím, že aktivují estrogenové receptory (ER). Metaanalýza podpořila účinnost suplementace sójovými isoflavony při zlepšování zrakové paměti u zdravých žen po menopauze . Studie SWAN Phytoestrogen Ancillary Study ukázala, že vysoký příjem izoflavonů nebo ligninu může zlepšit rychlost zpracování dat nebo verbální paměť v určité fázi menopauzy, ačkoli přínos byl také závislý na etnické/rasové příslušnosti . Účinek fytoestrogenů na zlepšení poznávacích schopností je zřejměji naznačen ve studiích na zvířatech. Hydroalkoholický extrakt ze semen pískavice řecké seno by mohl zmírnit poškození hipokampálních neuronů vyvolané ovariektomií (OVX) a zlepšit výkonnost učení a paměti na modelu potkanů .
Xiao-Yao-San (XYS), což v čínštině znamená šťastný a bezstarostný prášek, je přípravek tradiční čínské medicíny (TCM), který se používá k léčbě menopauzální úzkosti a deprese. Receptura se skládá z Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe) a Glycyrrhizae radix (Gancao). Systematická analýza zahrnující 26 randomizovaných studií ukázala, že XYS je lepší než antidepresiva, což naznačuje skóre Hamiltonovy škály deprese, a může zvýšit účinnost antidepresiv při zlepšování skóre sebehodnotící škály deprese . Perimenopauzální ženy s exoftalmem a palpitacemi by také mohly mít prospěch z léčby XYS . Některé terapeutické účinky XYS na zmírnění klimakterického syndromu lze přičíst přítomnosti fytoestrogenů. Řada studií uvádí přítomnost fytoestrogenů v XYS. Ergosterol se nachází v Poria cocos (Fuling) , a β-sitosterol je známý v Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini a kol. vyvinuli estrogen-chimerický receptor/Gal4-response element regulated/luciferase-reporter assay pro detekci přítomnosti fytoestrogenů v komplexních TCM formulích. Analyzovali Bupleurum & Peony Formula, modifikovanou formuli XYS se stejnými hlavními bylinami, a zjistili měřitelný obsah fytoestrogenů .
Přítomnost fytoestrogenů v XYS naznačuje, že XYS má potenciál léčit kognitivní poruchy způsobené nedostatkem estrogenů. Studie na zvířatech ukázala, že XYS může zmírnit chronický imobilizační stres (CIS) vyvolaný deficitem učení a paměti . V současné době žádná studie nehodnotila účinek XYS na zlepšení kognitivních poruch u žen v perimenopauze. Současná studie proto zkoumala účinek XYS na kognitivní schopnosti a jeho základní mechanismus u potkanů OVX.
2. Materiály a metody
2.1. Účinek XYS na kognitivní schopnosti u potkanů OVX. Zvířata a léčba
V této studii bylo použito celkem 60 samic potkanů Sprague-Dawley. Protokol studie byl schválen institucionální etickou komisí pro experimentální zvířata (číslo schválení: ACU170802). Zvířata byla ustájena s volným přístupem k vodě a standardní stravě za kontrolovaných teplotních a vlhkostních podmínek. Potkani byli náhodně rozděleni do 5 skupin (12 potkanů/skupina): skupina sham, OVX + fyziologický roztok nebo skupina O-saline, OVX + 17-β estradiol (E2) nebo skupina O-E2, OVX + XYS 9 g/kg nebo skupina O-XYS9 a OVX + XYS 3 g/kg nebo skupina O-XYS3. Potkani podstoupili operaci OVX v anestezii, jak je popsáno výše . Stručně řečeno, byl proveden podélný řez v jedné třetině trupu a 1-2 cm od každé strany páteře. Tuková tkáň byla jemně vytažena pinzetou. Byl identifikován vaječník a podvázány děložní rohy. Vaječník byl odstraněn a břišní řez byl zašit. Ve falešné skupině byl proveden řez břicha bez OVX.
Léčba byla zahájena dva týdny po operaci OVX a trvala šest týdnů. Potkani ve skupinách s léčbou XYS dostávali XYS perorální jehlou v jedné denní dávce 9 g/kg nebo 3 g/kg. Jako pozitivní kontrola léčiva byla stanovena subkutánní injekce E2 (2 μg/kg). Jako placebo kontrola bylo stanoveno podání 1 ml fyziologického roztoku (0,9 %). Odvar XYS byl použit ve formě extraktu (1 g/ml, což odpovídá 1 g surové byliny/ml), který poskytla přidružená nemocnice Nanjingské univerzity tradiční čínské medicíny. Vzorec odvaru XYS byl uveden vzácně. Dávka XYS používaná na klinice pro ženy v perimenopauze je 175 g surových bylin/60 kg, což odpovídá 3,5 g/kg u potkanů. S odkazem na další experimentální zprávy o krysím modelu jsme stanovili nízkou dávku na 3 g/kg a vysokou dávku na 9 g/kg . Prášek E2 (kat. č. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) byl rozpuštěn v malém množství ethanolu a poté byl připraven zásobní roztok o koncentraci 20 μg/ml s 0,9% fyziologickým roztokem.
2.2. Prášek E2 (kat. č. E2758, Sigma-Aldrich, St. Morrisův test vodního bludiště
Funkce učení a paměti potkanů byla hodnocena pomocí Morrisova testu vodního bludiště (MWM) . Experimentální zařízení MWM je kulatý bazén (o průměru 200 cm) s vodou o výšce 38-40 cm. Teplota vody je udržována na konstantní hodnotě 20-22 °C. Test WMW se skládá ze tří částí, a to z pokusu s prostorovou akvizicí (trvajícího 5 dní), pokusu s prostorovou sondou a pokusu s viditelnou plošinou. Při pokusu s prostorovou akvizicí byly krysy opatrně umístěny do náhodného kvadrantu vodní nádrže s plošinou skrytou 1,5 cm v severovýchodním kvadrantu pod vodou. Každému potkanovi bylo umožněno plavat až 60 s, aby plošinu našel. Potkani, kterým se nepodařilo najít plošinu během 60 s, k ní byli navedeni a latence byla zaznamenána jako 60 s. Latence úniku byla zaznamenána systémem videoanalýzy (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). Potkani byli trénováni 4krát denně. Po 5 dnech tréninku dostali potkani pokus s prostorovou sondou s odstraněnou plošinou ze severovýchodního kvadrantu. Potkani byli umístěni na stejné výchozí místo v severozápadním kvadrantu. Byly zaznamenány stopy cestování potkanů, kteří hledali plošinu za 120 sekund. Pro posouzení uchování prostorové paměti byla vypočtena doba trvání a křížové časy v cílovém kvadrantu. Druhý den po pokusu s prostorovou sondou absolvovali potkani pokus s viditelnou plošinou podobný tréninku se skrytou plošinou, při kterém byla plošina vyvýšena 1,5 cm nad vodní hladinu a umístěna v jihozápadním kvadrantu. Každý potkan byl vypuštěn čtyřikrát, a to pokaždé z jiného vstupního bodu. Byla zaznamenána úniková latence, plavecká vzdálenost a rychlost plavání.
2.3. Úniková latence, úniková vzdálenost a rychlost plavání Odběr vzorků
Po ukončení testu MWM byli potkani torakotomizováni a intubováni do vzestupné aorty přes levou komoru v anestezii pentobarbitalem sodným (40 mg/kg intraperitoneální injekcí). Krev z trupu byla odebrána pomocí zkumavky se sérovým separátorem pro detekci E2. Hipokampy šesti potkanů byly odděleny od mozkové kůry a okolních mozkových tkání, rychle odstraněny, promyty studeným PBS a zmrazeny v tekutém dusíku pro detekci E2 a Western blot. Tři neperfundované mozkové tkáně byly imobilizovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 24 hodin a použity pro barvení Golgiho a imunohistochemii. Tři zbývající potkani byli transkardiálně perfundováni studeným fyziologickým roztokem a následně fixováni 4% paraformaldehydem po dobu 1 h. Poté byl mozek vyjmut, fixován ve 4% paraformaldehydu po dobu 24 h a zalit do parafínu pro barvení TUNEL.
2.4. Detekce E2
Vzorky krve se nechaly srazit při pokojové teplotě a byly centrifugovány 15 min při 4 °C pro oddělení séra. Tkáně hipokampu byly zváženy, homogenizovány ve studeném fyziologickém roztoku a centrifugovány po dobu 20 min pro sběr supernatantu. Obsah E2 v séru a supernatantu z homogenátu hipokampu byl stanoven pomocí soupravy ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Šanghaj, Čína).
2.5 Obsah E2 v séru a supernatantu z hipokampu byl stanoven pomocí soupravy ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Šanghaj, Čína). Barvení Golgiho
Hipokampus byl rozřezán na malé bloky a zpracován pro barvení Golgiho podle popisu . Stručně řečeno, bloky hipokampu byly ponořeny do roztoku pro barvení Golgiho (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Šanghaj, Čína) na 14 dní, během nichž byl roztok barviva vyměňován každé 2-3 dny. Tkáně byly dehydratovány 30% sacharózou a rozřezány na 100 μm. Řezy byly zpracovány dehydratací etanolem, vyčištěny xylenem a upevněny na sklíčka potažená želatinou. U všech vzorků bylo úspěšně provedeno barvení podle Golgiho. Morfologie neuronů v hipokampu byla pozorována pod světelným mikroskopem (Nikon, Tokio, Japonsko). Neurony v oblasti CA1 hipokampu byly analyzovány pomocí zásuvného modulu Neuron J v softwaru Image J. Pro každého potkana bylo vybráno pět řezů a pro každý řez byly vybrány dendritické trny s kompletní morfologií . Byla změřena hustota a body větvení dendritických trnů
2.6. Imunohistochemie
Exprese podjednotek 2A a 2B N-methyl-D-aspartátového receptoru (NMDAR) v hipokampu byla stanovena imunohistochemicky podle standardního postupu . Použité primární protilátky byly králičí anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Čína) a králičí anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Čína). Sekundární protilátkou byla protilátka proti králičímu IgG konjugovaná s HRP (Servicebio).
2.7. Barvení TUNEL
Morfologické změny v hipokampu byly detekovány barvením TUNEL pomocí komerčního kitu (Roche, Mannheim, Německo) podle návodu. Řezy byly podrobeny kolorimetrické reakci DAB a následnému barvení hematoxylinem. Jádra apoptotických buněk pozitivních na TUNEL byla pod světelným mikroskopem hnědá. Pro každého potkana bylo vybráno pět řezů a pro každý řez byla vybrána tři neopakovatelná pole (zvětšení 400x). Bylo vypočteno procento TUNEL-pozitivních buněk ve všech buňkách.
2.8. Western Blot
Část mozku hipokampu CA1 byla rychle extrahována a rozřezána na malé řezy podle atlasu mozku. Tkáně hipokampu byly přes noc inkubovány s lyzačním pufrem RIPA (obsahujícím 100 Mm PMSF, zakoupeno od společnosti Servicebio). Buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací po dobu 10 min, aby byl zachycen supernatant obsahující bílkoviny. Koncentrace bílkovin byla stanovena pomocí soupravy BCA protein assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinové lyzáty (30 μg/l) byly separovány pomocí 10% SDS-PAGE a elektroblotovány na PVDF membránu. Po zablokování 5% odtučněným mlékem byla membrána přes noc sondována následujícími primárními protilátkami: králičí anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), králičí anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), králičí anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), králičí anti-ERα (1 : 2000, Millipore), králičí anti-fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), králičí anti-fosfatidylinositol 3-kináza (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), králičí anti-Bax (1 : 1000, Abcam), králičí anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) a králičí anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH byl detekován jako vnitřní kontrola. Poté byla membrána po dobu 1,5 h sondována sekundární kozí anti-králičí IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP) (1 : 5000, Bioworld). Pásy byly vizualizovány metodou chemiluminiscence. Průměrná optická hustota proteinových pásů byla kvantifikována pomocí softwaru Image J.
2.9. Statistická analýza
Experimentální data byla analyzována pomocí softwaru GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA). Číselné údaje byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Rozdíl mezi dvěma skupinami byl porovnán pomocí t-testu. Výsledky pokusu se skrytou plošinou byly analyzovány pomocí ANOVA s opakovanými měřeními skupina × den a následně Tukeyho post hoc. Ostatní vícenásobná srovnání byla analyzována pomocí jednosměrné ANOVA následované Tukeyovým post hoc. hodnota < 0,05 byla považována za statisticky významnou.
3. Výsledky
3.1. Odvar Xiao-Yao-San zlepšuje prostorové učení a paměťové schopnosti ovariektomovaných potkanů
Schopnost učení byla nejprve hodnocena pomocí pokusu o získání prostorových znalostí. ANOVA s opakovanými měřeními ukázala, že jak léčba, tak tréninkové dny ovlivnily latenci útěku (obrázek 1 a)). Úniková latence se ve všech skupinách snižovala s rostoucím počtem tréninkových dnů () a rozdíl byl významný i v trendu poklesu latence v rámci jednotlivých skupin (). Mezi léčbou a tréninkovými dny nebyla zjištěna žádná interakce (). Během prvních dvou dnů tréninku nebyl pozorován žádný významný rozdíl v únikové latenci jednotlivých skupin. Od třetího dne tréninku byla úniková latence významně delší než u falešné skupiny; úniková latence skupiny s E2 a vysokou dávkou XYS9 byla kratší než u skupiny s fyziologickým roztokem, ale nelišila se od únikové latence falešné skupiny. Po 5 dnech tréninku byli potkani hodnoceni sondou pro testování prostorové paměti. Jak ukazuje obrázek 1b, křížové časy, doba trvání a procento doby trvání v kvadrantu sondy se u skupiny s fyziologickým roztokem významně zkrátily. V době trvání v ostatních kvadrantech nebyl pozorován žádný rozdíl. Léčba XYS nebo E2 mohla významně obnovit křížové časy a dobu trvání v kvadrantu sondy na úroveň falešné skupiny. Aby se vyloučil vliv faktorů prostředí a kognitivní úrovně a úrovně aktivity pokusných zvířat na prostorové učení a paměť, podstoupili potkani také pokus s viditelnou plošinou (obrázek 1 c)). Mezi skupinami nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v latenci úniku, vzdálenosti plavání a rychlosti plavání. Souhrnně tyto výsledky naznačují, že prostorové učení a paměť byly u potkanů OVX narušeny a léčba vysokými dávkami XYS mohla účinně zlepšit narušené kognitivní funkce.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3,2. Odvar Xiao-Yao-San zvyšuje obsah estrogenů v hipokampu u ovariektomovaných potkanů
Dále jsme studovali vliv XYS na hladinu estrogenů u OVX potkanů. Jak je znázorněno na obrázku 2(a), léčba XYS nezlepšila hladinu estradiolu v séru sníženou v důsledku OVX; mezi skupinami s falešnou a OVX léčbou však nebyl žádný významný rozdíl v hladině estradiolu v séru. Za zmínku stojí, že vysoké dávky XYS a E2 zvýšily hladinu estradiolu v hipokampu ve srovnání s fyziologickým roztokem (obrázek 2b). Skupina O-XYS3 měla stále nižší hladiny hipokampálního estradiolu než skupina s falešným roztokem. Změnu obsahu E2 v hipokampu nelze vysvětlit změnou obsahu E2 pocházejícího z gonád, ale změnou syntézy in situ. Proto jsme v hipokampu zjišťovali expresi CYP19, konečného enzymu při syntéze estrogenů. Výsledky ukázaly, že léčba XYS nebo E2 může zvýšit expresi CYP19 ve srovnání se skupinou s fyziologickým roztokem (), ale pouze rozdíl mezi skupinami s vysokou dávkou XYS a fyziologickým roztokem byl významný (). Léčba neobnovila hladinu CYP19 na úroveň hladiny ve falešné skupině. Výsledky naznačují, že XYS podporuje expresi aromatázy v hipokampu, čímž zvyšuje de novo syntézu E2.
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
3,3. Odvar Xiao-Yao-San snižuje poškození neuronů v hipokampu ovariektomovaných potkanů
Morfologie buněk v hipokampu, zejména v oblasti CA1, hraje důležitou roli v kognitivních schopnostech . Morfologie buněk v hipokampu byla analyzována pomocí barvení podle Golgiho, jak je znázorněno na obrázku 3(a). Ve srovnání s falešnou skupinou se počet neuronů ve skupině s fyziologickým roztokem výrazně snížil a morfologie dendritických trnů byla poškozena. Další analýza neuronů CA1 ukázala, že bodový počet neuronů a hustota dendritických páteří se ve skupině s fyziologickým roztokem významně snížily (obr. 3(b) a 3(c)). Léčba vysokými dávkami XYS zvýšila počet neuronů v hipokampu a zvýšila bodový počet neuronů a hustotu páteří v oblasti CA1. Léčba E2 měla stejný terapeutický účinek jako vysoké dávky XYS. Nízká dávka XYS však účinně nezlepšila poškození neuronů v hipokampální oblasti CA1. V souladu s tím byla apoptóza hipokampálních neuronů (CA1, CA3, DG) snížena léčbou vysokými dávkami XYS nebo E2 (obr. 4). Nízká dávka XYS však mohla snížit pouze apoptózu neuronů CA3, ale neměla žádný účinek na neurony CA1 a DG. Celkově by vysoké dávky XYS mohly snížit poškození neuronů v hipokampu, zejména v oblasti CA1.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Odvar z Xiao-Yao-San zvyšuje hipokampální expresi NMDAR2A a NMDAR2B u ovariektomovaných potkanů.
Synaptická plasticita je neurobiologickým základem dlouhodobého učení a paměti a výkon v testu MWM je ovlivněn funkcí NMDAR . Proto jsme dále hodnotili expresi podjednotek NMDAR 2A a 2B v hipokampální CA1. Western blot (obrázky 5(a) a 5(b)) ukázal, že exprese NMDAR2A a NMDAR2B byla u potkanů OVX snížena. Léčba XYS nebo E2 významně zvýšila hladinu exprese těchto dvou proteinů na stejnou úroveň jako u falešné skupiny. Imunohistochemie (obrázek 5 c) rovněž ukázala, že podíl pozitivně obarvených buněk se v léčených skupinách zvýšil. Ve srovnání se skupinou s fyziologickým roztokem zvýšila vysoká dávka XYS významně expresi NMDAR2A i NDMAR2B ( a 0,013, resp.), ale nízká dávka XYS mohla významně zvýšit pouze expresi NMDAR2A ().
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.4. Odvar Xiao-Yao-San aktivuje signální dráhu PI3K prostřednictvím ERα
Vliv E2 nebo fytoestrogenů na fyziologii je zprostředkován signalizací ER. Studie ukázaly, že aktivace kinázy regulované extracelulárním signálem (ERK), mitogenem aktivované proteinkinázy, je nezbytná pro příznivé účinky E2 na paměť . Fosforylace ERK1/2 je závislá na aktivaci PI3K . Proto jsme zkoumali vliv XYS na signalizaci ER-PI3K . Jak ukazuje obrázek 6, vysoké dávky XYS a E2 významně podpořily expresi ERα, fosforylovaného ERα (Ser118) a PI3K p110β (katalytická podjednotka) ve srovnání se skupinou s fyziologickým roztokem. Aktivace ERα-PI3K dále snížila expresi proapoptotického faktoru Bax a zvýšila expresi antiapoptotického faktoru Bcl-2. Nízké dávky XYS však signalizaci ERα-PI3K významně neovlivnily, což je v souladu s výsledky na obrázcích 3 a 4.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Diskuse
XYS se již dlouho používá k léčbě perimenopauzální úzkosti a deprese. Naše studie zkoumala nové využití XYS při léčbě kognitivních poruch vyvolaných OVX. Výsledky ukázaly, že XYS účinně zlepšuje prostorové učení a prostorovou paměť u potkanů po OVX. Možným mechanismem je, že XYS podporuje de novo syntézu estrogenů v hipokampu, čímž aktivuje signální dráhu ERα-PI3K a inhibuje apoptózu hipokampálních neuronů.
Základní mechanismus XYS pro léčbu deprese byl rozsáhle studován. XYS hraje antidepresivní roli prostřednictvím regulace komplexní sítě zahrnující neurotransmitery, neurotrofiny, osu hypotalamus-hypofýza-nadledviny, aminokyseliny a lipidy . Některé z těchto studií ukázaly, že XYS může působit na změny v mozku související se stresem. Testy in vitro ukázaly, že sérum obsahující XYS může zvrátit změnu mitochondriálního membránového potenciálu, koncentrace volného vápníku a rychlosti apoptózy neuronů vyvolané oxidačním stresem . Naše studie ukázala, že XYS také tlumí apoptózu neuronů v oblasti hipokampu potkanů OVX. Antiapoptotické účinky XYS naznačují, že měl potenciál působit na řadu patologických procesů souvisejících s apoptózou mozkových neuronů.
Výsledky naší studie ukázaly, že XYS mohl obnovit hladinu estrogenů v hipokampu OVX potkanů. Hipokampus je nezbytný pro tvorbu paměti a je bohatý na ER a estrogen prostřednictvím těchto ER usnadňuje vyšší kognitivní a synaptické zdraví . Několik klinických studií naznačilo účinnost hormonální substituční terapie na kognitivní symptomy související se ztrátou estrogenů u žen . XYS by mohl zvýšit hladinu estradiolu v hipokampu, což by mělo být rozhodujícím základem jeho účinnosti při zlepšování kognitivních schopností OVX potkanů. XYS však nezvýšil hladinu estradiolu v séru. To může být způsobeno tím, že estradiol může být syntetizován de novo v hipokampu, zatímco estradiol v séru pochází z gonád . Naše výsledky ukázaly, že XYS zvýšil expresi CYP19 v hipokampu, což naznačuje, že zvýšený E2 v mozku pravděpodobně pochází z hipokampu . Výsledky naší studie ukázaly, že XYS zvýšil expresi NMDAR2A a NMDAR2B v hipokampu OVX potkanů. Toto zjištění bylo v souladu s předchozími studiemi. Bylo zjištěno, že estrogen zvyšuje hustotu dendritických páteří i počet synapsí v hipokampu prostřednictvím modulace funkce NMDAR u OVX potkanů . Estrogen by také mohl obnovit morfologii hipokampálních neuronů u starších potkanů obnovením hladiny NMDAR2B na úroveň pozorovanou u mladých v oblasti CA1; estrogen navíc může ovlivnit mobilitu NMDAR2A a NMDAR2B napříč synapse . Aktivace NMDAR by zase mohla přispívat k syntéze hipokampálního E2 indukcí přítoku Ca2+ .
Kromě NMDAR může XYS regulovat expresi dalších faktorů souvisejících s poznáním v mozku. Ztráta proteinu postsynaptické hustoty 95 (PSD-95), synaptofyzinu a neurotrofického faktoru odvozeného od mozku (BDNF) v hipokampu přímo souvisí s deficitem učení a paměti . Účinek XYS u potkanů s CIS souvisí s podporou exprese PSD-95 a synaptofyzinu v hipokampu . Bylo také prokázáno, že XYS reguluje BDNF ve frontální kůře, hipokampální oblasti CA1 a amygdale potkanů s CIS . Během procesu léčby CIS XYS byla v hipokampu inhibována signální dráha c-Jun N-terminální kinázy (JNK) .
Ačkoli jsme konkrétně nezkoumali, která složka je hlavní aktivní složkou XYS na učení a paměť, naše výsledky naznačují, že hlavní zdroj fytoestrogenů v XYS je kandidátem hodným dalšího zkoumání. Určité vodítko nám může poskytnout i výzkum antidepresiv. Jiali Liu a kol. na základě farmakochemické analýzy petroletherové frakce séra zjistili, že Bupleuri radix (Chaihu) je hlavním antidepresivem v receptuře XYS . Studie in vitro ukázala, že extrakt z Bupleuri radix podporuje proliferaci neuroblastomových buněk prostřednictvím aktivace dráhy PI3K/AKt . Aktivace PI3K byla pozorována i v naší studii. .
Současné klinické zprávy ukazují, že XYS má významný antidepresivní terapeutický účinek, ale neexistuje žádná jasná toxikologická studie o toxicitě a vedlejších účincích XYS v detailu. Obecně lze XYS považovat za lék na předpis bez přílišných vedlejších účinků. XYS má několik upravených receptů, jejichž základní složky jsou stejné jako u XYS. Nedávná metaanalýza hodnotila účinnost a bezpečnost modifikovaného XYS při léčbě perimenopauzálního syndromu. Souhrnné výsledky naznačují, že modifikovaný XYS by mohl být účinnější a bezpečnější při léčbě perimenopauzálního syndromu ve srovnání s hormonální substituční terapií . Vzhledem k nedostatečné metodice zahrnutých studií však účinnost a bezpečnost XYS potřebuje k potvrzení důkladnější studie. Pomocí metody 1H nukleární magnetické rezonance (NMR) výzkumná skupina Xiaoxia Gao uvedla, že frakce petroletheru obsahující lipofilní složky byla nejúčinnější frakcí pro léčbu deprese . Rovněž uvedli, že Bupleuri Radix, hlavní antidepresivní složka, může vyvolat větší toxické účinky v játrech nebo ledvinách zdravých potkanů než u potkanů s chronickým nepředvídatelným mírným stresem. Toxické účinky byly spojeny se zvýšenou koncentrací žlučových kyselin, usnadněním degradace lysinu a metabolickým narušením sfingolipidů, glycerofosfolipidů a mastných kyselin . Tento výsledek byl potvrzen v nedávné metabolomické studii pacientů s depresí. XYS hrál antidepresivní roli tím, že reguloval syntézu leucinu, valinu a isoleucinu a metabolismus dvojmocných kyselin, mastných kyselin, arginu a prolinu . Tyto studie naznačují, že je nutné pečlivě sledovat stav pacienta s včasnou úpravou dávky léku, aby se zabránilo toxickým nežádoucím účinkům.
5. Závěry
V této studii jsme prokázali, že léčba vysokými dávkami XYS má podobnou účinnost jako E2 při zlepšování kognitivních schopností potkanů OVX. Terapeutický účinek byl zprostředkován ochranou hipokampálních neuronů a obnovením hipokampální hladiny E2. Na tomto procesu se podílela signální dráha ERα-PI3K. Naše studie naznačuje, že XYS by mohl být možností léčby perimenopauzální kognitivní poruchy. V současné době se XYS používá především při léčbě klinické úzkosti a deprese. K ověření jeho účinku na zlepšení kognitivních funkcí je zapotřebí více klinických údajů.
Dostupnost údajů
Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou na vyžádání k dispozici u odpovídajících autorů.
Střet zájmů
Autoři prohlašují, že nejsou v žádném střetu zájmů.
Příspěvky autorů
Lina Liu a Fei Ge se na tomto výzkumu podíleli rovným dílem.
Poděkování
Tento výzkum byl podpořen Čínskou národní nadací pro přírodní vědy (National Natural Science Foundation of China) (grant č. 1). 81603578, 81503536, 81673795 a 81903974); Natural Science Foundation of Jiangsu Province (grant č. BK20181235); Jiangsu Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine (grant č. YB2017066); Nanjing Science and Technology Development Plan Project (grant č. 201715072); projekt nemocnice čínské medicíny provincie Ťiang-su (grant č. Y2018CX09); a projekt financovaný v rámci prioritního rozvoje akademických programů vysokých škol v Ťiang-su.
.