shRNA – Aplikace – Co je shRNA, jak funguje a jaké jsou její aplikace.

Co je to shRNA a jak se používá?

Sekvence krátké vlásenkové RNA (shRNA) jsou obvykle zakódovány ve vektoru DNA, který lze vnést do buněk pomocí transfekce plazmidem nebo transdukcí viru. molekuly shRNA lze na základě jejich designu rozdělit do dvou hlavních kategorií: jednoduché shRNA s kmenovou smyčkou a shRNA přizpůsobené mikroRNA. Jednoduchá shRNA s kmenovou smyčkou je často přepisována pod kontrolou promotoru RNA polymerázy III (Pol III). Transkript o 50-70 nukleotidech tvoří strukturu kmenové smyčky, která se skládá z 19 až 29 bp oblasti dvouřetězcové RNA (kmen) přemostěné oblastí převážně jednořetězcové RNA (smyčka) a dinukleotidového 3′ převisu . Jednoduchá shRNA s kmenovou smyčkou se přepisuje v jádře a vstupuje do dráhy RNAi podobně jako pre-mikroRNA. Delší (> 250 nukleotidů) shRNA přizpůsobená mikroRNA je konstrukce, která se více podobá nativním pri-mikroRNA molekulám a skládá se ze struktury kmene shRNA, která může obsahovat neshody podobné mikroRNA, přemostěné smyčkou a obklopené 5′ a 3′ endogenními sekvencemi mikroRNA . ShRNA přizpůsobená mikroRNA se stejně jako jednoduchý vlásenkový kmen se smyčkou také přepisuje v jádře, ale předpokládá se, že vstupuje do dráhy RNAi dříve podobně jako endogenní pri-mikroRNA.

Technologie shRNA jsou založeny na DNA, což poskytuje flexibilitu při návrhu vektoru. Většina systémů shRNA založených na vektorech obsahuje selektovatelný marker, který umožňuje eliminovat buňky, které nebyly úspěšně transfekovány nebo transdukovány, a udržovat buňky s trvalým vyřazením genu. Expresní kazety shRNA lze také začlenit do virových vektorových systémů, včetně retroviru, adenoasociovaného viru, adenoviru a lentiviru, které umožňují stabilní integraci do genomu hostitele a jeho expresi. Tyto virové strategie umožňují přenos shRNA do buněčných linií, které jsou refrakterní na transfekci. Pro sledování buněk exprimujících shRNA lze také použít fluorescenční markery (například zelený nebo červený fluorescenční protein). Účinnost shRNA je ovlivněna mnoha faktory, včetně účinnosti transdukce nebo transfekce, promotoru řídícího expresi shRNA a epigenetických modifikací (které mohou vést k utlumení exprese shRNA). Vliv, který má každý z těchto faktorů na výkonnost vektoru, se navíc může lišit v závislosti na buněčné linii nebo typu buňky. K dispozici jsou možnosti promotorů a reportérů SMARTchoice, které výzkumníkům pomáhají vybrat optimální promotory pro expresi shRNA a umlčení genů. A konečně, pokud jsou tyto expresní kazety shRNA spojeny s indukovatelnými promotory, jako je tomu u indukovatelných lentivirálních shRNA vektorů SMARTvector nebo vektorového systému TRIPZ, mohou výzkumníci navrhovat studie pro časovou a prostorovou modulaci genové exprese .

Video animace: RNA interference

Jak se shRNA dopravuje do buňky?

Existují dvě možnosti, jak shRNA na bázi DNA dopravit do buňky. V případě plazmidů lze použít typické transfekční metody, jako je použití lipidových transfekčních činidel nebo elektroporace. Lentivirální částice jsou vynikající volbou pro obtížně transfekovatelné buňky a v situacích, kdy je zapotřebí vysoká účinnost nebo je třeba dodat více konstruktů na buňku. Většina moderních vektorů má selektivní markery, které umožňují selektivní usmrcení buněk v kultuře, které nebyly úspěšně transfekovány nebo transdukovány, takže lze vytvořit čistou kulturu.

Co ovlivňuje funkci a specifičnost shRNA?

Optimální vyřazení genů je podmínkou úspěšné RNAi pomocí systémů shRNA. Racionální návrh sekvencí shRNA byl do značné míry založen na algoritmech vyvinutých u siRNA. Zatímco některá pravidla pro návrh siRNA platí i pro shRNA, dokonalejší algoritmy pro návrh shRNA pravděpodobně v budoucnu zlepší umlčování cílových genů u shRNA . Za účelem předpovědi funkčních sekvencí shRNA vybírá algoritmus SMARTvector™ shRNA společnosti Dharmacon cílové sekvence na základě mnoha kritérií, včetně preferencí nukleotidů závislých na poloze, sekundární struktury a profilů termodynamické stability specifických pro scaffold založený na mikroRNA SMARTvector. Algoritmus SMARTvector navíc zahrnuje několik kritérií pro zvýšení specifičnosti.

Stejně jako u siRNA lze bioinformatické přístupy použít k vytvoření cílově specifických shRNA při minimalizaci potenciálu pro off-target účinky. Je známo, že vysoké koncentrace meziproduktů umlčování přispívají k off-target událostem, ale hladinu meziproduktů je obtížné kontrolovat, pokud jsou shRNA exprimovány exogenně. Několik publikací dokládá, že za specifických podmínek může vysoká úroveň exprese jednoduché kmenové smyčky shRNA nasytit endogenní dráhu RNAi a vést k nezamýšleným fenotypům . Jiné studie naznačují, že použití shRNA přizpůsobené mikroRNA může snížit buněčnou toxicitu pro experimenty RNAi in vivo díky tomu, že tyto scaffoldy jsou účinněji zpracovávány jak Drosha-DGCR8, tak Dicerem .

aplikace shRNA

shRNA nabízí možnost prodlouženého umlčení genů. Transdukce shRNA na bázi virů umožňuje přístup k buňkám, jako jsou primární a neuronální buňky, které je obtížné transfekovat tradičními strategiemi na bázi kationtových lipidů. ShRNA na bázi virů byly také použity k hodnocení funkce genů v měřítku celého genomu pomocí poolů umlčovacích konstruktů. Skupinové nebo arrayed screeny jsou nyní široce používány k provádění vysoce výkonných screeningů k identifikaci genů potřebných v různých procesech, jako je přežívání a proliferace nádorových buněk , komponenty nádorových supresorových drah , modulátory savčích cirkadiánních hodin , supresory epiteliálně-mezenchymálního přechodu , hostitelské mediátory replikace HIV-1 a regulátory buněčné migrace . Síla sdruženého screeningu RNAi byla také rozšířena na screening funkce genů na zvířecích modelech pro zkoumání biologie in vivo .

Který nástroj shRNA je vhodný pro vaše potřeby?

Průvodce výběrem shRNA

Nabízíme výběr činidel a knihoven shRNA. Tento stručný průvodce výběrem vám pomůže určit nejlepší možnost pro vaše konkrétní potřeby.

Představené produkty

shRNA – produkty

• Lentivirální vektorová činidla pro RNA interferenci.

SMARTvektor Lentiviral shRNA

• Udělejte chytrý a informovaný výběr pro úspěšné umlčení genů v buňkách vašeho zájmu.

SMARTvektor indukovatelná shRNA

• Nejpokročilejší a nejflexibilnější jednovektorová indukovatelná shRNA, která je k dispozici pro přísně kontrolované umlčování genů.

Screeningové knihovny se sdruženými lentivirovými knihovnami

• Optimalizovaná konstrukce vysoce kvalitních poolů, kompletní analytické nástroje a validované protokoly jsou nezbytné pro úspěšný výsledek při screeningu se sdruženými lentivirovými knihovnami.

Doporučené zdroje

shRNA – zdroje

• Najdete zde průvodce produkty, často kladené dotazy a další informace.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Technická poznámka popisující experimentální pracovní postup SMARTchoice shRNA v suspenzních buňkách.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Platforma je inovativní systém ideální pro studie zprostředkované RNAi.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Experimentální protokoly pro knockdown genů pomocí GIPZ lentivirální shRNA.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing (Biogeneze mikroRNA: koordinované ořezávání a krájení). Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Systém pro stabilní expresi krátkých interferujících RNA v savčích buňkách. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Stabilní potlačení genové exprese pomocí RNAi v savčích buňkách. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Efektivní exprese malé interferující RNA v lidských buňkách. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Knihovny shRNA druhé generace pokrývající myší a lidský genom. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Funkční analýza různých promotorů v lentivirových vektorech v různých fázích in vitro diferenciace myších embryonálních kmenových buněk. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) Systematické srovnání relativních promotorových/enhancerových aktivit v savčích buněčných liniích. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentivirální vektory pro zvýšenou genovou expresi v lidských hematopoetických buňkách. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-like family of transcription factor 9, a differentiation-associated transcription factor, suppresses Notch2 signaling and inhibits glioblastoma-initiating stem cells. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji koordinuje kontrolu enzymatické aktivity PRC2 a obsazení cílových genů v pluripotentních buňkách. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Cytoplazmatický komplex FANCA-FANCC interaguje a stabilizuje cytoplazmaticky dislokovaný leukemický protein nukleofosmin (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Funkční identifikace optimalizovaných spouštěčů RNAi pomocí masivně paralelního senzorového testu. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatalita myší v důsledku přesycení buněčných drah mikroRNA/krátkých vlásenkových RNA. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Umělé miRNA zmírňují toxicitu zprostředkovanou shRNA v mozku: důsledky pro terapeutický vývoj RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Syntetické shRNA jako silné spouštěče RNAi. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC couples microRNA biogenesis and post-transcriptional gene silencing. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Vysoce paralelní identifikace esenciálních genů v nádorových buňkách. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profilování esenciálních genů v lidských mléčných buňkách pomocí multiplexního screeningu RNAi. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Objevování genů pro proliferaci rakoviny pomocí funkční genomiky. Science 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Kandidátní biomarkery odpovědi na experimentální lék proti rakovině identifikované pomocí rozsáhlého genetického screeningu s interferencí RNA. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) Velkoplošný funkční RNAi screen odhaluje roli CK2 v cirkadiánních hodinách savců. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 je negativním regulátorem epiteliálně-mezenchymálního přechodu a metastazování u karcinomu prsu. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) New HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) Celogenomový screening krátkých vlásenkových RNA v Jurkat T-buňkách na lidské proteiny přispívající k produktivní replikaci HIV-1. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) Onkogenomický in vivo RNAi screen identifikuje nádorové supresory u rakoviny jater. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Terapeutická inhibice miR-208a zlepšuje srdeční funkci a přežití při srdečním selhání. Circulation 124(14):1537-1547.