Počáteční problémyEdit
TermolabilityEdit
Počáteční použití rekombinázy FLP-FRT u savců nefungovalo. Protein FLP byl termolabilní (denaturovaný při zvýšených teplotách), a proto nebyl v savčím modelu použitelný kvůli zvýšeným tělesným teplotám těchto modelových systémů. Vzhledem k patentům a omezením používání rekombinace Cre-Lox však byl projeven velký zájem o výrobu termostabilnější kazety FLP-FRT. Jedny z prvních výsledků získali Buchholz et al. (1997) využitím cyklické mutageneze v Escherichia coli . Ve svém výzkumu autoři transfekovali buňky E. coli dvěma plazmidy: jeden kódoval náhodně mutované proteiny FLP za promotorem arabinózy a druhý obsahoval promotor genu lacZ v kazetě FRT. E. coli byly kultivovány na arabinózových plotnách při 37 °C a 40 °C, a pokud by došlo k rekombinaci, exprese lacZ by byla oslabena a kolonie by se jevily bílé. Z každé generace byly vybrány bílé kolonie a pěstovány na nových arabinózových deskách při stejných předchozích teplotách po dobu osmi generací. Poté, co byla rekombinace potvrzena pomocí western-blotu a mutované geny FLP byly sekvenovány, byl tento protein FLP osmé generace (FLPe) transfekován do kultury savčích buněk a rekombinace v savčích buňkách byla potvrzena. Tato varianta FLP má pouze 4 aminokyselinové záměny: P2S, L33S, Y108N a S294P.
Generování genetické mozaikyEdit
Genetický mozaicizmus nastává v organismu, když podobné typy buněk vyjadřují různé fenotypy v důsledku rozdílných genotypů v určitých lokusech. Zjednodušeně řečeno k tomu dochází, když jeden organismus obsahuje různé genotypy, což je v přírodě obvykle vzácné. Lze jej však snadno (a problematicky) vytvořit pomocí rekombinace FLP-FRT. Pokud jsou v buňce přítomna dvě různá místa FRT a FLP je přítomen ve vhodných koncentracích, bude kazeta FRT nadále vyříznuta a vložena mezi obě místa FRT. Tento proces bude pokračovat, dokud proteiny FLP neklesnou pod požadované koncentrace, což povede k tomu, že buňky v organismu budou mít různé genotypy. Tento postup byl pozorován od ovocných mušek až po myši a je nerozlišující vůči specifickým chromozomům (somatickým a pohlavním) nebo typům buněk (somatickým a zárodečným).
Určování buněčných liniíEdit
Před publikací Dymeckiho a spol. (1998) byla rekombináza Cre použita pro mapování buněčného osudu neuronálních progenitorů u myší pomocí promotoru En2. Autoři Dymecki et al. (1998) tedy vyslovili teorii, že rekombináza FLP by mohla být využita podobným způsobem s podobnou účinností jako rekombináza Cre u myší. Autoři vytvořili dvě transgenní myší linie: neuronální fúzní linii Wnt1::Flp a linii, která měla kazetu FRT lemující 18. exon tm1Cwr. Tento exon si autoři vybrali k excizi, protože jeho excize vede k nulovému fenotypu. Autoři tyto dvě linie spářili a nechali potomky dosáhnout dospělosti, než byli potomci usmrceni. Extrakce RNA byla provedena z neuronální, svalové, enterické a ocasní tkáně. Reverzní transkripční PCR a northern blotting potvrdily excizi 18. exonu tm1Cwr hojně v mozkové tkáni a mírně ve svalové tkáni (díky Scwhannovým buňkám ve svalu). Podle očekávání nebyla excize pozorována v jiných tkáních. Autoři pozorovali stejnou, ne-li lepší účinnost rekombinázy FLP při určování buněčného osudu než rekombinázy Cre.
U Drosophila melanogaster (Fruit Fly)Edit
K dnešnímu dni byla rekombináza Flp u D. melanogaster mnohokrát využita. Srovnání rekombinázy Flp s rekombinázou Cre u D. melanogaster publikovali Frickenhaus et al (2015). Autoři Frickenhaus et al. (2015) měli dvojí cíl: charakterizovat a porovnat účinnost Flp rekombinázy „knock-out“ s Cre rekombinázou „knock-out“ a RNAi knockdown a odhalit funkci cabezy (caz), mušího ortologa FUS, v neuronech a svalové tkáni D. melanogaster. FUS se výrazně podílí na vzniku amyotrofické laterální sklerózy (ALS) a frontotemporální demence u lidí . Autoři použili systém elav-Gal4/UAS-Flp nebo Cre k expresi rekombinázy specificky v neuronech a systém Mef2-Gal4/UAS-Flp nebo Cre k expresi specificky ve svalech. Autoři dospěli k závěru, že nástroj „knock-out“ rekombinázy Flp je pro účely vyřazení specifických genů ve specifických tkáních nebo buněčných liniích účinnější než RNAi i Cre rekombináza, a to díky absenci děravé exprese, která je patrná jak u proteinu Cre, tak u transkriptu RNAi. Autoři také zaznamenali toxicitu proteinu Cre, která není pozorována u proteinu Flp.
U Danio rerio (Zebrafish)Edit
Účinnost rekombinázového systému FLPe hodnotili u zebřiček Wong a spol (2009). Embryím, která byla hemizygotní pro zesílený zelený fluorescenční protein (EGFP) podél promotoru specifického pro svaly, byl vpraven protein FLPe. Bez FLPe by tato embrya měla exprimovat EGFP ve všech svalových tkáních a při křížení s divokým typem vlákna by 50 % výsledného potomstva mělo rovněž exprimovat EGFP ve svalové tkáni. Embrya, kterým byl aplikován FLPe, měla výrazně sníženou expresi EGFP ve svalové tkáni a byl pozorován i mozaicizmus. Když tato embrya dosáhla dospělosti, byla spářena s kmenem divokého typu a výsledné spřežení mělo výrazně méně potomků, kteří exprimovali EGFP ve svalové tkáni (0-4 %). Tyto výsledky ukazují, že FLPe je vysoce účinný nejen v somatických buňkách, ale také v zárodečné linii zebřiček,
V rostlináchEdit
Vytvoření „fytosenzorů“ nebo „sentinelů“ v Arabidopsis thaliana a tabákuEdit
Fytosenzory jsou geneticky modifikované rostliny, které mohou hlásit přítomnost biotických nebo abiotických kontaminantů. Je zřejmé, že produkce těchto modifikovaných rostlin je velkým příslibem pro zemědělství a laboratoře. Vytvoření vhodného reportérového vektoru se však ukázalo jako problematické. cis-regulační elementy hrají významnou roli v transkripční aktivaci genů v rostlinách a mnohé z nich nejsou dobře známy. Mnoho fytosenzorů buď nedostatečně exprimuje své reportérové geny, nebo hlásí falešně pozitivní výsledky kvůli syntetickým promotorům. Autoři Rao et al. (2010) využili k výrobě vysoce účinných fytosenzorů nástroj rekombinázy FLP. Autoři použili promotor tepelného šoku k indukci produkce FLP, zatímco vektor s lemováním FRT oddělil promotor CaMV 35S od genu pro beta-glukuronidázu (GUS). Když byly rostliny vystaveny tepelnému šoku, indukce FLP vedla k vyřazení vektoru s FRT, čímž se gen GUS účinně přesunul přímo za promotor CaMV 35S. Aktivace GUS vedla ke změně barvy listů rostlin ze zelené na modrou; fytosenzor tak účinně hlásil stres modelovému systému!
S Cre-rekombinázouEdit
Výroba expresního systému GRIM (gate-way-ready inducible MiRNA)Edit
RNA interference (RNAi) způsobila změnu paradigmatu v expresi genů a potenciálních genových knockoutů u eukaryot. Před výrobou expresního systému GRIM bylo vytváření vektorů RNAi nákladné a časově náročné. Vektory se vyráběly tradiční metodou kopírování a vkládání molekulárního klonování. Garwick-Coppens et al. (2011) vyvinuli mnohem účinnější metodu výroby RNAi vektorů, při níž lze expresi RNAi vyřadit pomocí Cre-rekombinázy a vyřadit pomocí Flp-rekombinázy. Nový expresní systém GRIM umožňuje mnohem rychlejší generování expresních vektorů obsahujících umělé RNAi konstrukty. Autoři dále ukázali, že jejich expresní systém funguje poměrně účinně v buňkách lidských embryonálních ledvin (HEK), což je běžná lidská imortalizovaná buněčná linie v molekulárním výzkumu.