Pozitivní funkční synergie strukturně integrovaných umělých proteinových dimerů sestavených pomocí Click chemie

Místa rozhraní Click chemie

Předpokládali jsme, že oblasti povrchu proteinu, které jsou kompatibilní z hlediska asociace, s větší pravděpodobností vytvoří integrovanou strukturu prostřednictvím tvorby vzájemně kompatibilních nekovalentních interakcí. Vzhledem k tomu, že proteiny jsou monomerní, jsou tyto interakce v nejlepším případě slabé a přechodné, takže nebudou trvalé, usoudili jsme, že potřebujeme molekulární „šroub“ jako součást místa rozhraní, který podpoří a stabilizuje všechny nové interakce. Prvním krokem je identifikace oblastí na cílových proteinech, které mají přirozený potenciál k interakci. Ke generování potenciálních konfigurací dimerů byl použit program ClusPro 2.040 (cluspro.org). Výsledné modely homodimerů sfGFP byly upřesněny, analyzovány a seřazeny pomocí programu RosettaDock41,42 (doplňková tabulka 1). Nejvýše hodnocená konfigurace je uvedena na obr. 1b (což je model nejbližší níže určené struktuře; vide infra), další 4 hodnocené konfigurace jsou uvedeny na doplňkovém obr. 1. Zatímco byly pozorovány různé orientace jednoho sfGFP vůči druhému, dokování odhalilo, že zbytky 145-148, 202-207 a 221-224 běžně přispívají k dimernímu rozhraní. K sešroubování obou proteinů byla použita geneticky kódovaná bioortgonální chemie Click (obr. 1a). Mezi výhody ve srovnání např. s disulfidovými vazbami patří delší postranní řetězce k překonání potenciálních sterických střetů, lepší stabilita příčných vazeb a možnost generovat nesymetrické (různá spojovací rezidua na různých monomerech) a heterodimery navrženým způsobem 1:1 (vide infra).

Na základě modelů dimerů byla vybrána tři rezidua pro náhradu dvěma Click kompatibilními ncAA, SCO43 (napjatý alkyn) a azF (azid)44,45 (obr. 1a). H148 a Q204 byly vybrány na základě jejich umístění na předpokládaném rozhraní dimeru (obr. 1b a doplňkový obr. 1). O obou zbytcích je známo, že jsou snadno modifikovány adukty malých molekul cyklooctynu při inkorporaci azF34,46 a leží v blízkosti funkčního centra, chromoforu sfGFP (CRO) (obr. 1b). Analýza pohybového posunu v gelu ukázala, že dimerizace proběhla úspěšně (obr. 1c, d); to bylo potvrzeno analýzou hmotnostní spektrometrie (doplňkový obr. 2). Reziduum 132 nebylo předpokládáno na dimerním rozhraní (obr. 1b a doplňkový 1), ale je známo, že je kompatibilní s řadou napjatých alkynových aduktů od barviv46 přes uhlíkové nanotrubičky35 až po jednovláknovou DNA36. Slouží tedy jako dobrý test naší schopnosti předpovídat rozhraní protein-protein a kompatibilitu s reakcí Click. Přestože je zbytek 132 povrchově exponovaný, nebyl při použití sfGFP132azF s proteinem obsahujícím SCO pozorován žádný dimerní produkt (doplňkový obr. 3), což ukazuje na důležitost kompatibility povrchového rozhraní a užitečnost in silico analýzy při identifikaci míst kompatibilních s click chemií. Buď sterické střety a/nebo interakce protein-protein, které přetrvávají delší dobu v jiných oblastech, mohou bránit kovalentnímu zesíťování v místě zbytku 132.

Pozitivní funkční přepínání při tvorbě dimeru sfGFP148x2

H148 tvoří H-vazbu s CRO (obr. 1b) a hraje důležitou roli při přesunu protonů, který reguluje populaci neutrální formy A (λmax ~ 400 nm, CRO A) a aniontové formy B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 přítomné v základním stavu. U sfGFP převažuje forma B, ale při začlenění azF na místo H148 (sfGFP148azF) vede odstranění vazby H k tomu, že nyní převažuje stav A33,34 (obr. 2a a tab. 1). Začlenění SCO na zbytek 148 (sfGFP148SCO) vyvolá podobný efekt, kdy převládá CRO A, ale s menším červeným posunem (λmax 492 nm) u minoritní formy CRO B (obr. 2a a tab. 1)

Dimerizace sfGFP148azF a sfGFP148SCO vyvolává dva významné pozitivní efekty: (i) zapíná fluorescenci při ~490 nm v důsledku podpory formy CRO B; (ii) výrazně zvyšuje jas díky zvýšenému molárnímu absorpčnímu koeficientu při 490 nm (obr. 2a a tab. 1). Hlavní excitační pík je při dimerizaci posunut do červena (λmax 492 nm) ve srovnání se sfGFPWT (λmax 485 nm) (Doplňková tabulka 3). Poměr absorbance 490:400 nm se posouvá o řád z ~0,5 pro monomery na ~5 pro dimery, přičemž v absorpčním spektru dimeru dominuje forma CRO B (obr. 2a), a to i přes zjevnou absenci druhu, který by mohl nahradit úlohu imidazolové skupiny H148. Předchozí příklady modifikace sfGFP148azF pomocí aduktů malých molekul nebo fotoaktivace vedly v nejlepším případě k částečné konverzi na formu CRO B33,34 . Desetinásobná změna absorbance se odráží v emisi fluorescence; excitace při 490 nm vede k ~20násobně vyšší emisi než u obou monomerů (obr. 2a). Dimer navíc vykazuje zvýšenou funkci i ve srovnání s původním supersloženým sfGFPWT (obr. 2b a tab. 1). Molární absorbance a jas se u sfGFP148x2 zvýšily o ~320 % (~160 % v přepočtu na CRO) (obr. 2b), což je více, než se očekává u prostého aditivního zvýšení, pokud monomerní jednotky působí nezávisle na sobě.

Pro zkoumání významu biortogonální vazby jsme zkonstruovali klasickou vazbu na bázi disulfidu mutací H148 na cystein. Varianty sfGFPH148C dimerizovaly, ale pouze v přítomnosti Cu2+ (doplňkový obr. 4). Spektrální vlastnosti naznačují, že dimer byl méně fluorescenční ve srovnání s sfGFP148x2 a sfGFPWT (doplňkový obr. 4). Monomer sfGFPH148C vykazoval očekávaný přepínač z CRO B na CRO A. Při dimerizaci sfGFPH148C byl sice pozorován přepínač z CRO A na CRO B, ale dimer měl nižší molární absorbanci na CRO než sfGFPWT a výrazně nižší než sfGFP148x2; stále byla pozorována významná populace A stavu. Emise fluorescence při excitaci při 490 nm byla u dimerního sfGFPH148C přibližně poloviční než u sfGFPWT. Biortogonální přístup tedy generoval lépe fungující dimerní druh než klasická vazba disulfidovou vazbou.

Molekulární základ pro funkční přepínání u sfGFP148x2

Krystalová struktura sfGFP148x2 (statistiky viz doplňková tabulka 2) ukazuje, že monomery tvoří rozsáhlé dimerní rozhraní s interakcemi dlouhého dosahu spojujícími obě CRO centra. Monomerní jednotky sfGFP148x2 jsou uspořádány v kvazisymetrickém uspořádání hlava-ocas posunutém vůči sobě o ~45° (obr. 3a). Antiparalelní uspořádání monomerů vedle sebe je nejblíže modelu s nejvyšším hodnocením (Doplňkový obr. 1 a Doplňková tabulka 1). Elektronová hustota nové triazolové příčné vazby je jasně definovaná (obr. 3b) a tvoří protáhlou anti-1,4-triazolovou vazbu, která je částečně pohřbená a úzce spojená s oběma monomerními jednotkami, takže tvoří nedílnou součást rozhraní dimeru (obr. 3c). CRO jsou od sebe vzdáleny 15 Å a směřují k sobě (obr. 3a).

Rozhraní má podobné vlastnosti jako přírodní dimery48. Pohřbená plocha rozhraní je ~1300 Å2 , přičemž se na ní podílejí obecně stejná rezidua z každého monomeru (obr. 3c, d). Důležitou roli hrají H-vazby, přičemž zbytky E142, N146, S147, N149 a N170 z obou monomerů přispívají k osmi mezipodjednotkovým H-vazbám (obr. 3b). Struktura ukazuje, že přirozená dimerní rozhraní lze napodobit a stabilizovat pomocí monomerů s vazbou Click, která byla podle původního modelování možná, ale kde byla pravděpodobně příliš slabá nebo přechodná, aby se udržela bez vložené vazby. Je tedy možné, že náš přístup by mohl být použit ke stabilizaci obecněji přechodných slabých interakcí protein-protein, takže by se vytvořila definovaná rozhraní.

Dimerizace vyvolává řadu konformačních změn za vzniku sítě interakcí na dlouhé vzdálenosti, která je základem mechanismu, jímž se sfGFP zapíná a zvyšuje jas. Struktura sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 ukazuje, že 148azF zaujímá podobnou pozici jako H148 v sfGFPWT, ale nemůže z kritické vazby H na fenolovou OH skupinu CRO, která podporuje tvorbu stavu CRO B. Při dimerizaci vede modifikace 148azF vytvořením triazolové vazby s 148SCO v příbuzném monomeru ke změně polohy jeho páteře i postranního řetězce, což způsobí vznik díry, kterou nyní může obsadit molekula vody v dimeru (W1azF na obr. 4a). Voda se může H-vázat s CROazF a karbonylem páteře 148azF (obr. 4). V monomerní jednotce sfGFP148SCO je přítomna ekvivalentní voda (W1SCO), která vytváří podobné interakce. Tyto strukturované molekuly vody mají potenciál nahradit interakci H-vazby ztracenou při odstranění H148, takže aktivují dimer podporou tvorby CRO B v základním stavu. Molekuly vody jsou také pohřbeny na rozhraní dimeru, takže dynamická výměna s objemovým rozpouštědlem bude mnohem menší. Navíc jsou nyní oba CRO spojeny rozšířenou sítí převážně vody, která se rozprostírá na rozhraní dimeru (obr. 4b, c). Analýza složení tunelu odhalila, že tři molekuly vody v každé jednotce (W1azF/SCO, W2azF/SCO a W3azF/SCO) jsou symetrické; W4 v kombinaci s páteří F145SCO tvoří most přes rozhraní dimeru, který spojuje obě vodní sítě. Dimerizace tak vytváří rozšířenou, na vodní vazby bohatou mezipodjednotkovou síť H, takže podporuje přechod ze stavu A CRO na formu B.

Analýza fluorescence jedné molekuly sfGFP148x2

K výzkumu fluorescenčního chování dimerů sfGFP148x2 na úrovni jedné molekuly byla použita mikroskopie s totálním vnitřním odrazem (TIRF). Časový průběh intenzity fluorescence jednotlivých dimerů sfGFP148x2 prokázal řadu intenzitních stavů, přičemž převládala fluorescence při ~80-100 počtech a vykazovala větší životnost než subpopulace stavů s vyšší intenzitou, které se vyznačovaly krátkými výpady do rozsahu intenzit od ~100 do 300 počtů (obr. 2c). Fluorescenční stopy rovněž vykazují prodlouženou fotostabilitu s dlouhou dobou do fotobleaku (obr. 2c a doplňkový obr. 5). Ve srovnání s tím sfGFPWT fotobledne rychleji, přičemž fluorescenční stopy vykazují jeden intenzitní stav, v němž zapnuté stavy obecně trvají kratší dobu (doplňkový obr. 6). Kromě toho bylo zjištěno, že monomerní sfGFPWT někdy existuje v počátečním tmavém, nefluoreskujícím stavu před zahájením fluorescence a následným fotobleachováním (doplňkový obr. 6). Extrakcí průměrného po sobě jdoucího času fluorescence „on time“ před fotobleachingem a obsazením přechodných nefluorescenčních stavů (blikání) bylo zjištěno, že sfGFP148x2 vykazuje delší období nepřetržité fluorescence (průměr 0,9 s) ve srovnání se sfGFPWT (0,65 s). Vzhledem k podobnosti naměřených intenzit fluorescence jednotlivých molekul přispívají delší doby zapnutí a doba fotobleaku pravděpodobně ke zvýšené fluorescenci pozorované při měřeních souboru sfGFP148x2 v ustáleném stavu (obr. 2a).

Ve snaze racionalizovat rozsah fluorescenčních stavů pozorovaných ve stopách dimerů byl vytvořen histogram všech naměřených intenzit (obr. 2c). Na rozdíl od sfGFPWT (doplňkový obr. 6), který vykazuje jedno logaritmicko-normální rozdělení49 , sfGFP148x2 upřednostňoval dvousložkový fit50 (obr. 2c). Naměřené rozložení intenzity vykazuje převažující pík nižší intenzity (~90 počtů) a částečně se překrývající pík vyšší intenzity, což je důsledek krátkých výpadů do stavů vyšší intenzity pozorovaných ve fluorescenčních stopách jednotlivých molekul. Zatímco u dimeru složeného ze dvou společně umístěných nezávisle aktivních fluoroforů by se za normálních okolností dalo očekávat bimodální rozložení intenzity, přičemž každý fluorofor postupně fotobledne, časové průběhy intenzity jednotlivých molekul tomuto modelu neodpovídají a ukazují nedostatek dvou dobře definovaných stavů. Jednoduché chování sfGFPWT ve stavu zapnuto/vypnuto je vzácně pozorováno ve stopách dimerů, které samy o sobě nepředstavují předpokládaný adukt dvou monomerních stop a místo toho vykazují složitější chování.

Zvýšená funkce při tvorbě dimeru sfGFP204x2

Abychom prozkoumali, jak mohou různá vazebná místa vyvolat funkční vlivy, zkoumali jsme výše zkonstruovaný alternativní dimer sfGFP204x2 (obr. 5a) (obr. 1d). Zjistili jsme, že dimerizace zlepšila spektrální vlastnosti nad úroveň prostého přidání monomerních nebo sfGFPWT proteinů, což opět zdůrazňuje synergické výhody dimerizace. Přidání azF nebo SCO na zbytek 204 mělo jen malý vliv na spektrální vlastnosti ve srovnání se sfGFPWT 46 (obr. 5b a tab. 1). V monomerních formách převažovala forma B CRO; molární absorbance i intenzita emise byly podobné jako u sfGFPWT. Emise fluorescence sfGFP204SCO byla mírně snížena (80 % sfGFPWT; tab. 1). Při vytvoření dimeru sfGFP204x2 (důkaz viz obr. 1d a doplňkový obr. 2) spektrální analýza ukázala funkční zlepšení z hlediska základních spektrálních parametrů: molárního absorpčního koeficientu (ε) a emise fluorescence (obr. 5b a tab. 1). Při dimerizaci se ε zvýšil až o 400 % ve srovnání s výchozími monomery na 160 000 M-1 cm-1. To odpovídá průměrné molární absorbanci na CRO 80 000 M-1 cm-1 , což je téměř dvojnásobný jas ve srovnání s výchozími monomery a o 31 000 M-1 cm-1 vyšší ve srovnání s sfGFPWT. V souladu se zvýšenou schopností absorbovat světlo se zvýšila i emise fluorescence; normovaná emise na CRO byla o 180 % vyšší než u monomeru sfGFP204azF. Pomocí výpočtu Strickler-Berg51 (webová stránka huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) klesla doba života fluorescence z 3,2 ns pro sfGFPWT na 0,92 ns pro sfGFP204x2. Stejně jako u sfGFP148x2 má tedy dimerní struktura sfGFP204x2 zvýšenou pravděpodobnost elektronické excitace a fluorescenčního výdeje ve srovnání s monomerní formou (viz doplňkový obr. 8 pro spektrální srovnání dimerů). To je pro obě dimerní formy o to působivější, že sfGFPWT je měřítkem pro výkonnost zeleného fluorescenčního proteinu.

Důležitost symetrie pro synergii

Přírodní proteinové homodimery jsou obecně symetrické1,52 a taková symetrie byla napodobena v našem umělém dimeru prostřednictvím společného zbytku příčné vazby. Zkoumali jsme význam společného příčného vazebného zbytku (jako napodobeniny strukturní symetrie) pro funkční synergii. Výhodou biortogonální chemie je, že vzájemně kompatibilní reakční úchyty umožňují konstrukci definovaných dvojic (tj. 148 + 204 = 148-204, a nikoli 148-148 nebo 204-204), takže se zabrání vzniku nežádoucích produktů, které bude obtížné oddělit.

Byly vytvořeny dimery, které spojovaly zbytek 148 a 204 ve dvou dostupných kombinacích (148SCO+204azF a 148azF+204SOC). Fluorescence v ustáleném stavu odhalila, že v obou dimerních formách byly jasně přítomny protonované a deprotonované formy CRO (obr. 6a, b). U dimeru vázaného na 148azF-204SCO došlo ke změně relativní populace forem A a B, přičemž se výrazně zvýšil molární absorpční koeficient při 490 nm (obr. 6a); byl téměř dvojnásobný oproti původnímu sfGFP204SCO a o ~30 % vyšší, než se předpokládalo prostým sečtením spekter monomerů. Relativní výška píku 400 nm zůstává podobná jak u sfGFP148azF, tak u dimeru spojeného s 148azF-204SCO, což naznačuje, že populace deprotonované formy je v dimeru podobná jako u původního monomeru. Dimerizace prostřednictvím kombinace 148SCO-204azF změnila relativní populace protonované a deprotonované formy, ale snížení absorpčního píku 400 nm nebylo doprovázeno současným zvýšením píku 490 nm (obr. 6b). Ve skutečnosti byla dimerizace do značné míry škodlivá, protože oba hlavní absorpční píky měly nižší molární absorpční koeficient než prostá adiční spektra monomerů (obr. 6b). Je zřejmé, že asymetricky spojené dimery jsou méně fluorescenční a obsahují významnou smíšenou populaci obou stavů CRO ve srovnání se symetricky spojenými dimery, takže v tomto případě má symetrie důležité funkční důsledky.

Heterodimery a funkční integrace

Heterodimery, kdy je dimer složen ze dvou různých proteinů, jsou běžně pozorovaným alternativním stavem dimerizace1,2. Umožňuje nám také navrhovat nové komplexy, v nichž mohou být spojeny funkčně odlišné proteiny. Výhodou bioortogonálního spojování je možnost vytvářet definované, jednodruhové (hetero)dimery složené ze dvou různých proteinových jednotek (tj. směs A + B = A-B, nikoli A-A, B-B, A-B, kterou lze obtížně oddělit). Jako partnerský protein k sfGFP byl vybrán žlutý fluorescenční protein Venus29 vzhledem k tomu, že se oba proteiny spektrálně překrývají (doplňkový obr. 9). Sekvenční rozdíly jsou uvedeny na doplňkovém obr. 10.

SfGFP148SCO byl kombinován s ekvivalentním azF obsahujícím Venusem (Venus148azF) za účelem vytvoření GFVen148 (důkaz viz doplňkový obr. 11). Objevují se nové spektrální charakteristiky, které naznačují, že byl vytvořen integrovaný systém. Vytvořením GFVen148 vzniká dimer, který vykazuje lepší jas ve srovnání s sfGFP148SCO nebo Venus148azF (obr. 7a a doplňková tabulka 3). Zajímavé je, že dimer má střední spektrální vlastnosti jednotlivých monomerů bez výrazného rozšíření píků (obr. 7a, b a doplňkový obr. 12a), což naznačuje, že se obě centra CRO funkčně integrovala z hlediska emise fluorescence. Hlavní λmax je 505 nm, což je střední hodnota mezi sfGFP (492 nm) a Venus (517 nm). Hodnota ε odpovídající formě B CRO (oblast 490-510 nm) se výrazně zvyšuje (~4-5krát) a je vyšší než u prostých aditivních spekter monomerů, zatímco populace A CRO klesá, ale je stále pozorovatelná (obr. 7a). Tomu odpovídá i ~4násobné zvýšení intenzity emise při excitaci na vlnové délce 505 nm (obr. 7b). Je pozorován jediný emisní pík, který je rovněž intermediární mezi oběma monomery, bez ohledu na vlnovou délku excitace (λEM při 517 nm; obr. 7b, c); při excitaci při 490 nm (schopné excitovat oba CRO) byl pozorován jediný, nikoli dvojitý nebo rozšířený pík, což naznačuje, že emituje jediný druh. Aditivní spektrum spekter jednotlivých monomerů, které simuluje dva nezávisle působící proteiny, podporuje myšlenku nové integrované funkce, protože je širší a červeně posunuté ve srovnání s naměřeným emisním profilem GFVen148x2 (doplňkový obr. 12b). Emise při excitaci při 400 nm byla také měřena, protože Venus148azF má při této vlnové délce malou absorbanci ve srovnání s GFVen148. Intenzita emise byla 30krát vyšší pro GFVen148 ve srovnání s monomerním Venus148azF s vrcholem emise při 517 nm (obr. 7c a doplňkový obr. 12c). Zdá se, že GFVen148 nevykazuje klasický FRET, jak by se dalo očekávat (vide supra), ale chová se jako jediná entita, pokud jde o fluorescenční výstup. To by mohlo naznačovat, že dva CRO nyní působí převážně jako jeden druh, přičemž roli hrají strukturní aspekty pozorované u sfGFP148x2 (např. vodní síť). Přítomnost významného neutrálního stavu A CRO však naznačuje, že obě monomerní jednotky nejsou plně synchronizovány. To však nepopírá jasný vliv, který může mít dimerizace na vytváření nových spektrálních vlastností, jako jsou ty, které jsou pozorovány u GFVen148.

Stejně jako u sfGFP mělo začlenění azF na místo Q204 (označované jako Venus204azF) malý vliv na spektrální vlastnosti Venus (doplňková tabulka 3). Kovalentní spojení přes 204 SPAAC (čímž vznikl GFVen204) úspěšně vytvořilo dimer (doplňkový obr. 11). GFVen204 spojil spektrální vlastnosti obou monomerů a vytvořil druh s λMax při 490 i 514 nm (poměr 1:1,2) (obr. 7e, f a Doplňková tabulka 3). Venus204 rovněž absorbuje při 490 nm, ale v poměru 1:2,7 k 514 nm. Tvorba dimerů opět zvýšila molární absorbanci nad absorbanci jednotlivých monomerů; zejména ε se zvýšilo o ~26 000 M-1 cm-1 (~27 %) pro λmax spojené s Venus (514 nm), kde je malý příspěvek pro sfGFP. Pro zkoumání komunikace mezi monomery byla sledována emise fluorescence při excitaci na čtyřech různých vlnových délkách: 400 nm (pouze sfGFP; 450 nm (sfGFP, minoritní Venus); 490 nm (sfGFP λmax, rameno Venus); 510 (Venus, minoritní sfGFP). Při všech excitačních vlnových délkách byl jediný jasný emisní pík při 528 nm (obr. 7b), odpovídající Venus indikující komunikaci pomocí Försterova rezonančního přenosu energie (FRET). Emisní pík korelující s sfGFP204SCO (~510 nm) nebyl pozorován ani při excitaci na nižších vlnových délkách specifických pro sfGFP. Nebyl pozorován ani střední emisní pík charakteristický pro GFVen148, což zdůrazňuje nové vlastnosti heterodimeru 148. Nejvýraznější rozdíl byl pozorován při excitaci na vlnové délce 400 nm, kde došlo ke 14násobnému zvýšení intenzity emise na vlnové délce 528 nm pro GFVen204 ve srovnání s Venus204azF (obr. 7f, vložka). Vypočtená relativní účinnost FRET po spektrálním rozkladu byla přibližně 90 %. Obě funkční centra tedy komunikují prostřednictvím přenosu energie (obr. 7g) vysoce účinným způsobem.

.