Regulace pohyblivosti centrálním párem
Změny pohyblivosti v reakci na vnější podněty mohou mít jednu ze dvou podob. Podnět může měnit frekvenci náhodné změny orientace, jak k tomu dochází u bakterií, takže pohyblivost v příznivém směru je odměňována, nebo může podnět přímo regulovat pohyblivost tak, že se organismus otáčí v definovaném směru vzhledem k podnětu (směrem k podnětu u pozitivní taxe, pryč u negativní taxe). Takové taktické otáčení vyžaduje lokalizované receptory, které mohou fungovat jako anténa, a pohybový aparát, který může být směrově řízen (Foster a Smyth, 1980). Jednoduchá regulace typu stop-reorient-start nevyžaduje sofistikovanou regulaci pohyblivosti. U bičíků vyžaduje směrová regulace koordinované změny tvaru vlny a frekvence kmitů, a tedy sofistikovanější regulační aparát. U 9+2 řasinek a bičíků tuto úlohu plní systém centrálních párových paprsků, jak bylo nejelegantněji demonstrováno u Chlamydomonas (obr. 1D). Tato jednobuněčná dvoubičíkatá řasa reaguje na fototaktické podněty změnou relativního průběhu, rychlosti zdvihu a frekvence úderů svých dvou bičíků (Witman, 1993). Dostupné důkazy naznačují, že fototaxe zahrnuje cestu přenosu signálu z centrálního aparátu přes radiální paprsky do regulačního komplexu spojeného s dvojbičíkem, který pak mění vzorec dyneinové aktivity, a tím i tvorbu a šíření záhybů prostřednictvím změn proteinových kináz a fosfatáz spojených s dyneinem (Porter a Sale, 2000; Smith a Yang, 2004).
Ačkoli mohlo existovat více možných způsobů, jak vytvořit asymetrický centrální aparát, jako první se mohl vyvinout aparát postavený na minimálním lešení ze dvou mikrotubulů, který by vyžadoval minimální změnu protocilu, především přidání nového místa iniciace sestavy v přechodové zóně spolu se strukturou (radiální špice) pro přenos signálů z centrálního aparátu k dyneinům asociovaným s dvojčaty. Představujeme si, že radiální špice se vyvinuly z regulace dyneinů v listech dublet, kde interagovaly na svých základnách s regulačním komplexem dyneinů asociovaných s dubletami a na svých koncích s proteiny asociovanými s mikrotubuly na jiné řadě dublet nebo na kortikálním singletovém mikrotubulárním cytoskeletu. Vzhledem k pravděpodobnosti, že se bičíkové dyneiny vyvinuly z cytoplazmatických dyneinů, se zdá pozoruhodné, že pro tyto dvě dyneinové rodiny nejsou známy žádné společné regulační mechanismy. To však může odrážet spíše náš současný nedostatek znalostí než absenci konzervovaných mechanismů. Nedávná molekulární analýza proteinu v dyneinovém regulačním komplexu Chlamydomonas odhalila primární strukturu, která má skutečně podobnost s cytoplazmatickými proteiny, ale vztah k cytoplazmatickým dyneinům nebyl prokázán (Rupp a Porter, 2003).
Vyřešení specifických vzorců interakce mezi výběžky z centrálního páru mikrotubulů a radiálních ramen, které vyvolávají specifické změny v dyneinové aktivitě, zůstává velkou hádankou. Nedávné výsledky naší laboratoře, včetně analýzy normální struktury centrálního páru, charakterizace mutantů s defektní montáží centrálního páru a určení orientace centrálního páru během šíření ohybu, omezují modely toho, jak CP reguluje dynein. Zde se pokusíme syntetizovat hypotézu regulace centrálního páru v souladu s těmito výsledky.
Předchozí elektronová mikroskopie tenkých řezů axonem Chlamydomonas a Tetrahymena spolu s negativně barvenými preparáty komplexů centrálního páru z řasinek Tetrahymena (Chasey, 1969) a bičíků spermií potkana (Olson a Linck, 1977) odhalila asymetrickou strukturu komplexů centrálního páru a definovala mikrotubul CP s delšími výběžky v průřezu a periodicitou opakování 32 nm jako C1, zatímco druhý (C2) má kratší výběžky s opakováním pouze 16 nm. Porovnáním příčných a podélných tenkých řezů komplexů centrálního páru divokého typu s komplexy centrálního páru z montážních mutantů pf6 a cpc1 jsem určil strukturní vztahy a periody opakování pro většinu výběžků spojených s C1 a C2 v Chlamydomonas. Povrchové pohledy poskytnuté stereosnímky rychle zmrazených, hluboce leptaných preparátů potvrdily a rozšířily tyto závěry a vedly k poměrně kompletní trojrozměrné rekonstrukci centrálního páru (Mitchell, 2003a). Tyto studie poskytují model potenciálních míst interakce spór na centrálním páru a zejména ukazují nespojitosti na jinak válcovitém povrchu CP podél povrchů mikrotubulů, které směřují k sousedním hlavičkám spór. Zdůrazněna je také celková asymetrie komplexu CP, která naznačuje jedinečné interakce spojek v různých radiálních polohách kolem válce CP. Klonování genů pf6 (Rupp et al., 2001) a cpc1 (Mitchell a Sale, 1999; Zhang a Mitchell, 2004) a identifikace jejich genových produktů neidentifikovaly zjevné kandidáty na proteiny, které interagují s radiálními špicemi, ale protein podobný kinesinu (Klp1) na mikrotubulu C2 (Bernstein et al., 1994) je atraktivním kandidátem na protein vázající špice. Nedávno jsme ukázali, že bičíky v buňkách s vyřazeným Klp1 bijí s dramaticky sníženou frekvencí (Mitchell a Yokoyama, 2003).
Studie EM ukazují, že CP si u některých organismů udržuje pevnou orientaci vzhledem k buněčnému tělu a vnějším dubletám, zatímco u jiných má CP variabilní orientaci. Z fylogenetického hlediska se zdá, že pevná orientace je odvozeným zjednodušením u organel, které mají pevnou rovinu ohybu, jako jsou řasinky hřebenových destiček ktenophor (Tamm a Tamm, 1981) a mnoho spermií metazoí (Sale, 1986). V extrémních příkladech jsou mikrotubuly C1 a C2 připojeny k dubletám 8, resp. 3 trvalými vazbami (buď modifikovanými paprsky, nebo akcesorními strukturami). Opačným extrémem jsou řasinky a bičíky jednobuněčných organismů, které při reakci na podněty z prostředí spoléhají na rychlé změny tvaru vlny, frekvence kmitů a účinné orientace tahu. CP v těchto organelách jsou zkroucené, takže neudržují pevnou orientaci od základny ke špičce v rámci okolních 9 dublet. Kromě toho se tyto zkroucené CP během šíření ohybu otáčejí (Omoto et al., 1999). Nedávno jsme ukázali, že CP Chlamydomonas je v každém ohybu orientována rovnoběžně s rovinou ohybu (obr. 1D) a mezi po sobě následujícími hlavními a zpětnými ohyby se stáčí o 180° a že mikrotubul C1 je vždy nejblíže dubletám na vnější straně každého ohybu (Mitchell, 2003b). Tato konstantní orientace CP vzhledem k ohybu u Chlamydomonas umožňuje, aby jedna sada výběžků CP interagovala s radiálními paprsky připojenými k dubletám s aktivními dyneiny, zatímco jiná sada výběžků CP interaguje s radiálními paprsky na dubletách s neaktivními dyneiny.
Ačkoli je beatový obal u Chlamydomonas téměř planární a směr hlavních ohybů se dramaticky nemění od konstantní roviny, u jiných organismů tomu tak není. Pokud orientace CP sleduje orientaci ohybů i u těchto jiných organismů, jak navrhuji, pak je CP vždy umístěna tak, aby zajišťovala flexibilní řízení motility. Naše nedávné výsledky ukazují, že orientace CP se pasivně přizpůsobuje ohybům, které se tvoří na bázi bičíku Chlamydomonas, a pak se tato orientace závislá na ohybu přemisťuje, jak se každý ohyb šíří od báze ke špičce. Analogií ze strojírenství je šnekové soukolí, v němž je rotace šneka (centrálního páru) závislá na kolmém pohybu (šíření ohybu) vzájemně se prolínajících ozubených kol ozubeného kola (axonemálních ohybů). Směr hlavního ohybu tedy nemůže být určen orientací centrálního páru, který se pasivně přizpůsobuje ohybům, ale musí být regulován na úrovni vnějšího dubletu prostřednictvím iniciačních vzorců na bičíkaté bázi. Regulační signály z CP pak mohou určovat tvar a frekvenci kmitů prostřednictvím přímé modulace vzorců dyneinové aktivity v rámci vyvíjejících se a šířících se ohybů. Tato hypotéza je v souladu s výsledky vibrační reorientace roviny rytmu axonemů mořských ježků (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Pokud si nová rovina ohybu vyvolaná vibracemi vynutí novou orientaci centrálního páru, pak by relaxace systému po odstranění vnucených vibrací z těchto buněk vyžadovala postupnou rotaci centrálního páru zpět do klidové polohy. Bohužel v těchto experimentech nebyly získány informace o skutečné orientaci CP. Tato hypotéza je také v souladu se vzorcem klouzání dublet pozorovaným v axonémech Chlamydomonas ošetřených proteázami, v nichž vzorce klouzání dublet udržují konstantní vztah k orientaci centrálního páru (Wargo a Smith, 2003; Wargo et al., 2004), a se studiemi aktivity dyneinu v narušených axonémech Chlamydomonas (Smith, 2002) a mořských ježků (Yoshimura a Shingyoji, 1999; Nakano a kol., 2003), které vykazují modulaci aktivity závislou na vápníku a centrálním páru.
Jakou výpovědní hodnotu mají tyto spekulace o evoluci řasinek a bičíků? Za prvé předpokládáme, že vývoj povrchové pohyblivosti bičíků je primitivní a pravděpodobně se s ním setkáváme široce, a to i u derivátů řasinek, které nebijí. Je zřejmé, že IFT je nezbytnou a univerzální pohyblivostí pro sestavování pohyblivých i nepohyblivých organel, takže vazba tohoto mechanismu na mimobuněčný pohyb může být stejně rozšířená. Za druhé, sekvestrace receptorů na řasinkových membránách je také primitivní a pravděpodobně představuje hlavní selekční tlak pro další existenci nepohyblivých primárních řasinek, stejně jako silněji modifikovaných řasinek smyslových orgánů. Vzhledem k tomu, že řasinkové deriváty zajišťují základní funkce ve smyslových neuronech mnoha organismů, je třeba jen malého skoku představivosti, abychom předpokládali, že protocilium také tvořilo ancestrální platformu pro všechny smyslové procesy a že další funkce této organely mohou být společné pro smyslové transdukční kaskády. Za třetí, orientace centrozomu jako indikátoru buněčné polarity a směru migrace u pohyblivých buněk je také velmi primitivní. Pokud je tomu tak, význam protocilu jako raného determinantu buněčné polarity a směrované migrace naznačuje, že je třeba hledat další souvislosti mezi mechanismy, které určují buněčnou polaritu, a mechanismy, které orientují centrozomy/centrioly spolu s cytoplazmatickým uspořádáním mikrotubulů. A konečně, regulace řasinek a bičíků pomocí centrálního páru se také musela vyvinout velmi brzy v evoluci eukaryot, ještě před radiací všech existujících eukaryotických fylů. Ačkoli nepochybně existují rozdíly v detailní regulaci, kterou tyto organely vyžadují u různých organismů a typů buněk, měli bychom očekávat, že najdeme mnoho univerzálních rysů ve způsobu, jakým interakce centrálního páru a radiálních ramen regulují dyneinovou aktivitu, a možná ještě najdeme společná témata v regulaci axonemálních a cytoplazmatických dyneinových motorů.
.