PMC

Reprezentativní výsledky

Schopnost plakových testů přesně vyhodnotit titry virů závisí na mnoha faktorech: vhodném výběru hostitelských buněk, vhodných médiích a růstových podmínkách pro buněčnou a virovou životaschopnost, imobilizovaném množení virů a přesném stanovení doby inkubace virů, aby byla dostatečná doba pro zřetelnou a počitatelnou tvorbu plaků.

Pro tuto studii byly vybrány viry ze tří reprezentativních rodin, aby se ukázaly rozdíly v: výběru překryvných látek, inkubační době a morfologii plaků u různých typů vzorků. Jako modelový virus (+)ssRNA byla vybrána venezuelská koňská encefalitida (VEEV), která může způsobit významné onemocnění u koňovitých a lidí a reprezentuje čeleď Togaviridae. Kmen chřipky B Taiwan, segmentovaný (-)ssRNA virus infikující především člověka, reprezentuje čeleď Orthomyxoviridae. Jako zástupce čeledi Bunyaviridae byl vybrán virus horečky údolí Rift (RVFV), (-)ssRNA virus pocházející z členovců, který primárně infikuje členovce, přežvýkavce a člověka.

Pro RVFV (obrázek 1) byly stanoveny titry ze zásobního roztoku rekombinantního živého oslabeného kmene MP12 RVFV ve formátu 12 jamek s použitím CMC, agarosových nebo Avicelových překryvů, které byly inkubovány vedle sebe po dobu 72 hodin po infekci (hpi). Reprezentativní destička zobrazující ředění v rozmezí 10-4 až 10-7 je vidět na panelu A. Destičky s použitím CMC a agarosových nánosů vykazovaly malé, jasné a zřetelné destičky s dobře definovaným kruhovým ohraničením. Plaky s tekutým překrytím byly ve srovnání s agarosovými a CMC plaky o něco hojnější a větší a poskytovaly méně zřetelný okraj. V panelu B byly porovnány titry virů, přičemž všechny překryvné vrstvy vykazovaly srovnatelné výsledky.

V zájmu získání jasnějšího vizuálního srovnání mezi překryvnými vrstvami pro MP12 spolu s větší velikostí vzorku pro stanovení reprodukovatelnosti byla také vyzkoušena destička se 6 jamkami v trojím opakování (obrázek 2). Ve formátu destičky se 6 jamkami vykazovalo použití CMC překryvu menší plaky než agarosové nebo tekuté překryvy, které byly vzájemně srovnatelné. Zatímco titry virů byly u všech tří překryvů podobné (panel D), plaky vytvořené v agarosových a tekutých překryvech se ukázaly být snadněji spočitatelné díky své větší velikosti.

Na rozdíl od RVFV se titry VEEV a morfologie plaků mezi různými překryvy výrazně lišily (obrázek 3A). Plaky vytvořené v CMC překryvech vykazovaly jasnou a zřetelnou morfologii při použití 12jamkového formátu destiček na úkor velikosti a citlivosti plaků (panel B). Na rozdíl od CMC se při použití agarosových a tekutých překryvů vytvořily výrazně větší plaky, což svědčí o nižší inhibici viru a zvýšené citlivosti k replikaci VEEV. To bylo již dříve potvrzeno při pouhém porovnání agarózy a CMC v práci publikované Juarezem a kol.4. Zatímco agaróza a tekuté překryvy vytvářely větší plaky než CMC, plaky měly špatně definované hranice a bylo obtížné je spočítat ve formátu 12 jamek, přičemž tekuté překryvy poskytovaly největší difúzi hranic. Když byly plaky zkoušeny v destičkách se 6 jamkami (Obrázek 4), větší formát 6 jamek negoval problém zjevně velkých plaků, které bylo obtížné rozlišit ve formátu 12 jamek, přičemž agarosové a tekuté překryvy se ukázaly být lepší než překryvy CMC, pokud jde o definici plaků a citlivost (Obrázek 4D).

V porovnání s RVFV nebo VEEV poskytuje chřipka při plakování několik jedinečných výzev, jako je požadavek externí proteázy. Citlivost viru chřipky na různý výběr překryvných látek byla v minulosti také dobře zdokumentována, protože byly zaznamenány významné změny při použití tak drobných modifikací, jako jsou různé značky agarózy9.

Zajímavé je, že u kmene chřipky B Taiwan mělo použití CMC jako překryvné látky za následek výrazně menší plaky, které bylo obtížné spočítat a ukázalo se, že je obtížné je spolehlivě vyhodnotit (obrázek 5A). Použití agarosového překryvu poskytlo nejlepší plaky (panel C) a vedlo k tmavšímu zabarvení pozadí (pravděpodobně v důsledku zvýšené životaschopnosti monovrstvy) a vykazovalo jasnější a ostřejší plaky v přímém srovnání s použitím tekutého překryvu (panel B).

Zřetelná výhoda tekutých polymerů oproti pevným a polotuhým překryvům, jako je agaróza a CMC, spočívá ve snadném odstranění a aplikaci. Polotuhé překryvy vyžadují zahřívání a tuhnutí se může ukázat jako problematické při manipulaci a odstraňování. Za účelem využití těchto výhod a určení praktičnosti použití přípravku Avicel vysoce výkonným způsobem pro RVFV byl vyzkoušen formát 96 jamkových destiček s různými koncentracemi překryvu (obrázek 6). Pro RVFV MP-12 byla ředění provedena ve čtyřech opakováních při 0,6 a 1,2% konečné koncentraci přípravku Avicel. Aplikace a odstranění překryvu se ukázaly jako jednoduché, přičemž nebyly zaznamenány žádné zjevné rozdíly mezi opakováními ani mezi jednotlivými koncentracemi, což svědčí o vysokém stupni reprodukovatelnosti. Při bodování byly plaky zřetelné a spočitatelné pouhým okem, což prokazuje proveditelnost použití tekutých překryvů vysoce výkonným způsobem pro RVFV.

Obrázek 1:Srovnání překryvů plaků RVFV s použitím 12 jamkových destiček. Veros byly rozmístěny v počtu 2,5 x 105 buněk ve 12jamkových destičkách a infikovány 200 µl s použitím stejného sériově naředěného výchozího vzorku MP12. Po infekci bylo použito 1,5 ml překryvných vrstev 0,3% agarózy, 0,6% Avicelu nebo 1% CMC (konečné koncentrace), aby bylo možné přímo porovnat překryvné vrstvy, jak je znázorněno na panelu A. Plaky byly spočítány a otitulkovány na panelu B .

Obrázek 2:Porovnání překryvných vrstev RVFV s použitím 6jamkových destiček. Veros byly rozmístěny v počtu 5 x 105 buněk v 6jamkových destičkách a infikovány 400 µl s použitím stejného sériově naředěného výchozího vzorku MP12. Byly použity tři ml překryvné vrstvy 0,3% agarózy, 0,6% Avicelu nebo 1% CMC, aby bylo možné přímo porovnat překryvné vrstvy, jak je ukázáno na panelech A, B a C. Samostatné experimenty byly provedeny identicky, jak je popsáno pro panely A-C, přičemž plaky byly spočítány a otitulkovány na panelu D (N = 3).

Obrázek 3:Porovnání překryvných vrstev VEEV s použitím 12jamkových destiček. Veros byly naneseny v počtu 2,5 x 105 buněk na 12jamkové destičky a infikovány 200 µl s použitím stejného sériově naředěného výchozího vzorku vakcinačního kmene VEEV TC-83. Po infekci bylo použito 1,5 ml překryvných vrstev 0,3% agarózy, 0,6% Avicelu nebo 1% CMC, aby bylo možné přímo porovnat překryvné vrstvy, jak je ukázáno na panelu A. Plaky byly spočítány a otitulkovány na panelu B.

Obrázek 4: Porovnání překryvných vrstev VEEV s použitím 6jamkových destiček. Veros byly rozmístěny v počtu 5 x 105 buněk v 6jamkových destičkách a infikovány 400 µl s použitím stejného sériově naředěného výchozího vzorku VEEV TC-83. Po infekci byly použity 3 ml překryvné vrstvy 0,3% agarózy, 0,6% Avicelu nebo 1% CMC, aby bylo možné přímo porovnat překryvné vrstvy, jak je ukázáno na panelech A, B a C. Samostatné experimenty byly provedeny identicky, jak je popsáno u panelů A – C, přičemž plaky byly spočítány a otitulkovány na panelu D (N = 3).

Obr. 5:Porovnání překryvných vrstev chřipkových plaků. Buňky MDCK byly rozmístěny v počtu 5 x 105 buněk v destičkách se 6 jamkami a infikovány 400 µl inokula s použitím stejného sériově naředěného výchozího vzorku chřipky B Taiwan. V růstových médiích ani v překryvných vrstvách nebylo použito fetální hovězí sérum (FBS), protože FBS může inhibovat šíření chřipky prostřednictvím inhibice určitých proteáz, které jsou nezbytné pro fúzi virů. TPCK-trypsin byl přidán do všech překryvných vrstev před aplikací, aby se usnadnila fúze viru a jeho vstup do hostitelských buněk. Po infekci byly aplikovány 3 ml nánosů 0,3% agarózy, 0,6% Avicelu nebo 1% CMC, aby bylo možné přímo porovnat nánosy, jak je ukázáno na panelech A , B a C. Samostatné experimenty byly provedeny identicky, jak je popsáno na panelech A – C, přičemž nánosy byly spočítány a otitulkovány na panelu D (N = 3). Zatímco pro plaky CMC byl stanoven průměr, ukázalo se, že je obtížné je spolehlivě spočítat, protože vykazovaly difúzní okraje a velmi malé rozměry plaků.

Obrázek 6:Vysoce výkonné překryvy plaků. Na 96jamkové destičce Veros nanesené v počtu 3 x 104 buněk na jamku bylo infikováno 50 µl inokula s použitím stejného sériově naředěného výchozího vzorku RVFV MP12 po dobu 1 hodiny, a to ve čtyřnásobném opakování. Pro překryvy byly vyzkoušeny 0,6 a 1,2% konečné koncentrace přípravku Avicel, aby se určila proveditelnost a reprodukovatelnost použití tekutých překryvů vysoce výkonným způsobem, panely A a B.

Tabulka 1:Podmínky inokulace plaku a typy buněk

Tabulka 2:Plakové a virové/buněčné růstové médium

Překryvné roztoky při výrobě nepropadají, pokud je zachována sterilita.

Tabulka 3:Zásoba překryvných roztoků

Tabulka 4: Formáty destiček

.