Obecný postup blotování začíná extrakcí celkové RNA z homogenizovaného vzorku tkáně nebo z buněk. Eukaryotickou mRNA lze poté izolovat pomocí oligo(dT) celulózové chromatografie, aby se izolovaly pouze ty RNA, které mají poly(A) ocas. Vzorky RNA se pak rozdělí pomocí gelové elektroforézy. Protože gely jsou křehké a sondy nemohou proniknout do matrice, vzorky RNA, nyní rozdělené podle velikosti, se přenesou na nylonovou membránu pomocí kapilárního nebo vakuového blotovacího systému.
Nastavení kapilárního blotovacího systému pro přenos RNA z elektroforetického gelu na blotovací membránu.
Nylonová membrána s kladným nábojem je nejefektivnější pro použití v severním blotování, protože záporně nabité nukleové kyseliny k nim mají vysokou afinitu. Přenosový pufr používaný pro blotting obvykle obsahuje formamid, protože snižuje teplotu žíhání interakce sonda-RNA, čímž eliminuje potřebu vysokých teplot, které by mohly způsobit degradaci RNA. Jakmile je RNA přenesena na membránu, je imobilizována kovalentním navázáním na membránu pomocí UV světla nebo tepla. Po označení sondy se sonda hybridizuje s RNA na membráně. Experimentální podmínky, které mohou ovlivnit účinnost a specifičnost hybridizace, zahrnují iontovou sílu, viskozitu, délku duplexu, neshodné páry bází a složení bází. Membrána se promyje, aby se zajistilo, že se sonda navázala specificky, a aby se zabránilo vzniku signálů v pozadí. Hybridní signály se poté detekují pomocí rentgenového filmu a lze je kvantifikovat pomocí denzitometrie. K vytvoření kontrol pro porovnání v severním blotu lze po stanovení pomocí mikročipů nebo RT-PCR použít vzorky, které nevykazují genový produkt, který vás zajímá.
GelyUpravit
RNA probíhá na formaldehydovém agarózovém gelu, aby se zvýraznily ribozomální podjednotky 28S (horní pás) a 18S (spodní pás).
Vzorky RNA se nejčastěji separují na agarózových gelech obsahujících formaldehyd jako denaturační činidlo pro RNA za účelem omezení sekundární struktury. Gely lze před blotováním obarvit ethidium bromidem (EtBr) a prohlédnout pod UV světlem, aby bylo možné pozorovat kvalitu a množství RNA. Polyakrylamidovou gelovou elektroforézu s močovinou lze rovněž použít při separaci RNA, ale nejčastěji se používá pro fragmentovanou RNA nebo mikroRNA. Vedle vzorků na elektroforézním gelu se často používá žebříček RNA, aby bylo možné pozorovat velikost získaných fragmentů, ale ve vzorcích celkové RNA mohou ribozomální podjednotky sloužit jako markery velikosti. Protože velká ribozomální podjednotka je 28S (přibližně 5 kb) a malá ribozomální podjednotka je 18S (přibližně 2 kb), objeví se na gelu dva výrazné pásy, z nichž větší má téměř dvojnásobnou intenzitu než menší.
SondyEdit
Sondy pro northern blotting se skládají z nukleových kyselin s komplementární sekvencí k celé nebo části RNA, která je předmětem zájmu, mohou to být DNA, RNA nebo oligonukleotidy s minimálně 25 komplementárními bázemi k cílové sekvenci. RNA sondy (ribosondy), které jsou transkribovány in vitro, jsou schopny vydržet přísnější promývací kroky, čímž se zabrání části šumu pozadí. Běžně se vytváří cDNA se značenými primery pro zájmovou sekvenci RNA, která slouží jako sonda v northern blotu. Sondy musí být označeny buď radioaktivními izotopy (32P), nebo chemiluminiscencí, při níž alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza (HRP) rozkládají chemiluminiscenční substráty za vzniku detekovatelné světelné emise. Chemiluminiscenční značení může probíhat dvěma způsoby: buď je sonda připojena k enzymu, nebo je sonda značena ligandem (např. biotinem), pro který je ligand (např. avidin nebo streptavidin) připojen k enzymu (např. HRP). Rentgenový film může detekovat jak radioaktivní, tak chemiluminiscenční signály a mnoho výzkumníků dává přednost chemiluminiscenčním signálům, protože jsou rychlejší, citlivější a snižují zdravotní rizika, která jsou spojena s radioaktivními značkami. Stejnou membránu lze zkoumat až pětkrát, aniž by došlo k výrazné ztrátě cílové RNA.
.