Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) afkooksel is een formule uit de traditionele Chinese geneeskunde. Deze studie onderzocht het effect van XYS op cognitieve vaardigheden en het onderliggende mechanisme bij ratten met ovariectomie. Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten werden geovariectomiseerd en behandeld met XYS (3 g/kg of 9 g/kg) via een maagsonde, met onderhuidse injectie van 17-β estradiol (E2, 2 μg/kg) als een positieve medicijncontrole en een maagsonde van 1 ml zoutoplossing (0,9%) als een placebo-controle. Na 6 weken behandeling werden de ratten onderzocht met behulp van de Morris water doolhof test. Het oestradiolgehalte in het serum en in de hippocampus werd gemeten met behulp van ELISA. Golgi-kleuring werd uitgevoerd om de neuronale morfologie in de hippocampus te observeren. Apoptose van hippocampale cellen werd waargenomen door TUNEL kleuring. Het eiwitgehalte van N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) 2A en 2B in de hippocampale CA1 regio werd bepaald door Western blot en immunohistochemie. Expressie van oestrogeen receptor (ER) en PI3K signalering werd gedetecteerd door Western blot. Vergeleken met de sham groep, waren zowel het leren als het geheugen aangetast bij de ratten met ovariectomie. Ratten behandeld met E2 of hooggedoseerde XYS vertoonden een beter leervermogen en geheugen vergeleken met de met zout behandelde ratten. Hoge dosis XYS verminderde significant de ontsnappingslatentie in de ruimtelijke acquisitie proef; ondertussen werden de kruistijden en de duur in het sonde kwadrant verhoogd in de ruimtelijke sonde proef. Hoge dosis XYS bevorderde de de novo synthese van E2 inhoud in de hippocampus, maar had geen significant effect op het serum E2 niveau. Golgi kleuring gaf aan dat hoge dosis XYS het aantal vertakkingen en de dichtheid van dendritische stekels in de hippocampus CA1 gebied kon verhogen. TUNEL kleuring toonde aan dat hoge-dosis XYS ovariectomie-geïnduceerde neuronale apoptose verlichtte. Het expressieniveau van NMDAR2A en NMDAR2B in hippocampus CA1 werd verhoogd door XYS behandeling. Het gunstige effect van XYS was door activering van ERα-PI3K signalering. Concluderend kan een hoge dosis XYS behandeling de cognitieve vaardigheden van geovariectomiseerde ratten verbeteren door de hippocampale neuronen te beschermen en het hippocampale E2 niveau te herstellen.
1. Inleiding
Perimenopauzale vrouwen lijden vaak aan angst en depressie gerelateerd aan oestrogeenspiegel fluctuatie. Naast angst en depressie is vergeetachtigheid een andere veel voorkomende klacht bij perimenopauzale vrouwen. De Seattle Midlife Women’s Health Study meldde dat 60% van de vrouwen van middelbare leeftijd een verslechtering van het geheugen opmerkten . Uit de Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) bleek dat de perimenopauze een afhankelijke risicofactor was voor zelfgerapporteerde vergeetachtigheid bij vrouwen van middelbare leeftijd. Omdat de hersenen een belangrijk doelwit van oestrogeenregulering zijn, wordt gespeculeerd dat oestrogeentekort verantwoordelijk kan zijn voor de cognitieve stoornis. Echter, de resultaten van observationele studies over de invloed op cognitie zijn niet volledig consistent. Bovendien moeten doeltreffende therapeutische hormooninterventies om de cognitieve prestaties te verbeteren nog worden vastgesteld. Bovendien kunnen andere factoren, zoals waargenomen stress, stemming, en lichamelijke gezondheid, ook bijdragen aan geheugenklachten . De ovariële oestrogeenproductie zal waarschijnlijker het geheugen beïnvloeden in het geval van abrupte daling eerder dan natuurlijke overgang . In tegenstelling tot de inconsistentie in menselijke studies, ondersteunen de bevindingen in geovariectomiseerde dieren de associatie van oestrogeentekort met cognitieve veranderingen en efficiëntie van hormoonvervangingstherapie .
Supplementatie met fyto-oestrogenen is een populaire alternatieve therapie om de symptomen van de menopauze te verlichten. Fyto-oestrogenen, zoals flavonoïden, isoflavonen en lignanen, hebben een structuur die vergelijkbaar is met steroïdale oestrogenen en kunnen een oestrogeenachtige rol spelen door oestrogeenreceptoren (ER’s) te activeren. Een meta-analyse ondersteunde de efficiëntie van suppletie met soja-isoflavonen bij het verbeteren van het visuele geheugen bij gezonde postmenopauzale vrouwen. De SWAN Phytoestrogen Ancillary Study toonde aan dat een hoge inname van isoflavonen of lignine de verwerkingssnelheid of het verbale geheugen in een bepaald stadium van de menopauze kon verbeteren, hoewel het voordeel ook etniciteit/ras-gerelateerd was . Het effect van fyto-oestrogenen op de verbetering van de cognitie is duidelijker aangetoond in dierstudies. Een hydroalcoholisch extract van fenegriekzaden kon de door ovariectomie (OVX) veroorzaakte schade aan de hippocampale neuronen verzachten en de leer- en geheugenprestaties in een rattenmodel verbeteren.
Xiao-Yao-San (XYS), wat in het Chinees gelukkig en zorgeloos poeder betekent, is een formule uit de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) die wordt gebruikt om angst en depressie in de menopauze te behandelen. De formule bestaat uit Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe), en Glycyrrhizae radix (Gancao). Een systematische analyse van 26 gerandomiseerde onderzoeken toonde aan dat XYS superieur was aan antidepressiva, zoals blijkt uit de scores op de Hamilton depressieschaal, en de werkzaamheid van antidepressiva kon versterken wat betreft het verbeteren van de zelfbeoordelingsscores op de depressieschaal. Perimenopauzale vrouwen met exophthalmie en hartkloppingen kunnen ook baat hebben bij een behandeling met XYS. Sommige therapeutische werkingen van XYS bij het verlichten van het menopauzesyndroom kunnen worden toegeschreven aan de aanwezigheid van fyto-oestrogenen. Een aantal studies heeft de aanwezigheid van fyto-oestrogenen in XYS gerapporteerd. Ergosterol wordt aangetroffen in Poria cocos (Fuling) , en β-sitosterol is bekend te zijn aanwezig in Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini et al. ontwikkelden een oestrogeen-chimeric receptor/Gal4-response element regulated/luciferase-reporter assay voor het opsporen van de aanwezigheid van fyto-oestrogenen in complexe TCM-formules. Zij analyseerden Bupleurum & Pioen formule, een aangepaste formule van XYS met dezelfde hoofdkruiden en vonden een meetbaar fyto-oestrogeen gehalte.
De aanwezigheid van fyto-oestrogenen in XYS suggereert dat XYS het potentieel heeft om cognitieve stoornissen veroorzaakt door oestrogeentekort te behandelen. Een dierstudie toonde aan dat XYS chronisch immobilisatie stress (CIS) geïnduceerde leer- en geheugentekort kon verzachten. Tot op heden heeft geen enkele studie het effect van XYS op het verbeteren van cognitieve stoornissen bij perimenopauzale vrouwen geëvalueerd. Daarom onderzocht de huidige studie het effect van XYS op cognitieve vaardigheden en het onderliggende mechanisme bij OVX ratten.
2. Materialen en Methoden
2.1. Dieren en behandeling
In totaal werden 60 vrouwelijke Sprague-Dawley ratten gebruikt in deze studie. Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie van Experimentele Dieren (goedkeuringsnummer: ACU170802). De dieren werden gehuisvest met vrije toegang tot water en standaard voeding onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheidsgraad. De ratten werden willekeurig verdeeld in 5 groepen (12 ratten/groep): sham groep, OVX + zoutoplossing of O-saline groep, OVX + 17-β estradiol (E2) of O-E2 groep, OVX + XYS 9 g/kg of O-XYS9 groep, en OVX + XYS 3 g/kg of O-XYS3 groep. De ratten ondergingen een OVX operatie onder narcose zoals eerder beschreven. Kort gezegd werd een longitudinale incisie gemaakt in een derde deel van de romp en 1-2 cm van elke kant van de ruggengraat. Het vetweefsel werd voorzichtig uitgetrokken met een pincet. De eierstok werd geïdentificeerd en de baarmoederhoornen werden afgebonden. De eierstok werd verwijderd, en de abdominale incisie werd gehecht. In de sham groep, werd de buik ingesneden zonder OVX.
De behandeling werd gestart twee weken na de OVX operatie en duurde zes weken. De ratten in de XYS-behandelingsgroepen kregen XYS via een maagsonde in een enkele dagelijkse dosis van 9 g/kg of 3 g/kg. Subcutane injectie van E2 (2 ug / kg) werd ingesteld als een positieve drug controle. Gavage van 1 ml zoutoplossing (0,9%) werd ingesteld als een placebo-controle. Het XYS afkooksel werd gebruikt in de vorm van een extract (1 g/ml, gelijk aan 1 g ruwe kruiden/ml), dat werd geleverd door het Affiliated Hospital van Nanjing University of Traditional Chinese Medicine. De formule van het XYS-afkooksel werd nauwkeurig gerapporteerd. De dosis XYS die in de kliniek wordt gebruikt voor perimenopauzale vrouwen is 175 g ruwe kruiden/60 kg, wat overeenkomt met 3,5 g/kg bij ratten. Verwijzend naar andere experimentele rapporten over het rattenmodel, stellen wij de lage dosis vast op 3 g/kg en de hoge dosis op 9 g/kg . E2 poeder (Cat. nr. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) werd opgelost in een kleine hoeveelheid ethanol, en vervolgens werd 20 μg/ml stocking oplossing bereid met 0,9% zoutoplossing.
2.2. Morris Water Maze Test
Het leren en geheugen functie van ratten werd beoordeeld met behulp van de Morris water doolhof (MWM) test . Het MWM-experimenteerapparaat is een rond zwembad (200 cm in diameter) met 38-40 cm hoog water. De watertemperatuur wordt constant gehouden op 20-22°C. De MWM-test bestaat uit drie delen, namelijk de ruimtelijke acquisitieproef (die 5 dagen duurt), de ruimtelijke sondeerproef, en de zichtbare platformproef. In de ruimtelijke acquisitie proef, werden de ratten voorzichtig in een willekeurig kwadrant van de watertank geplaatst met het platform verborgen 1,5 cm in het noordoostelijke kwadrant onder het water. Elke rat werd toegestaan om te zwemmen voor maximaal 60 s om het platform te vinden. Ratten die er niet in slaagden het platform binnen 60 s te vinden, werden erheen geleid en de latentie werd geregistreerd als 60 s. De ontsnappingslatentie werd geregistreerd door een videoanalysesysteem (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). De ratten werden 4 keer per dag getraind. Na 5 dagen training, ratten kregen de ruimtelijke sonde proef met het platform verwijderd uit het noordoosten kwadrant. Ratten werden geplaatst op dezelfde startlocatie in het noordwest kwadrant. De reissporen van de ratten op zoek naar het platform in 120 s werden opgenomen. De duur en de kruistijden in het doel kwadrant werden berekend om de retentie van het ruimtelijk geheugen te beoordelen. De volgende dag na de ruimtelijke sonde proef, kregen de ratten het zichtbare platform proef vergelijkbaar met de verborgen platform training, waarbij het platform werd verhoogd 1,5 cm boven het wateroppervlak en geplaatst in het zuidwestelijke kwadrant. Elke rat werd 4 keer vrijgelaten, en elke keer vanuit een ander ingangspunt. De ontsnappingslatentie, de zwemafstand en de zwemsnelheid werden geregistreerd.
2.3. Sample Collection
Na afloop van de MWM-test, werden de ratten thoracotomized en geïntubeerd in de opgaande aorta via de linker ventrikel onder verdoving met natriumpentobarbital (40 mg / kg via intraperitoneale injectie). Stam bloed werd verzameld met behulp van serum afscheider buis voor de detectie van E2. Hippocampi van zes ratten werden gescheiden van de cerebrale cortex en de omliggende hersenweefsels, snel verwijderd, gewassen met koude PBS, en bevroren in vloeibare stikstof voor detectie van E2 en Western blot. Drie niet-geperfundeerde hersenweefsels werden geïmmobiliseerd in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur en gebruikt voor Golgi kleuring en immunohistochemie. De linker drie ratten werden transcardially doorbloed met koude zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde fixatie gedurende 1 uur. Hersenen werden vervolgens verwijderd, gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, en ingebed in paraffine voor TUNEL kleuring.
2.4. E2 Detectie
Bloedmonsters mochten stollen bij kamertemperatuur en werden gecentrifugeerd bij gedurende 15 min bij 4 ° C om serum te scheiden. Hippocampus weefsels werden gewogen, gehomogeniseerd in koude zoutoplossing, en gecentrifugeerd op gedurende 20 min om supernatant te verzamelen. E2 gehalte in serum en hippocampus homogenaat supernatant werd gedetecteerd door ELISA kit (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China).
2.5. Golgi kleuring
De hippocampus werd gesneden in kleine blokken en verwerkt voor Golgi kleuring zoals beschreven. Kort gezegd, werden de hippocampus blokken ondergedompeld in Golgi kleuring oplossing (Sinopharm Chemical Reagent Co, Ltd, Shanghai, China) gedurende 14 dagen, waarin de kleurstof oplossing werd vervangen om de 2-3 dagen. Weefsels werden gedehydrateerd met 30% sucrose en gesneden op 100 pm. Secties werden verwerkt met ethanol dehydratie, geklaard met xyleen, en gemonteerd op gelatine-gecoate dia’s. Golgi kleuring werd met succes uitgevoerd in alle monsters. De morfologie van de neuronen in de hippocampus werd geobserveerd onder een lichtmicroscoop (Nikon, Tokyo, Japan). De neuronen in de CA1 regio van de hippocampus werden geanalyseerd met behulp van de Neuron J plugged in de Image J software. Vijf secties werden geselecteerd voor elke rat, en dendritische stekels met volledige morfologie werden geselecteerd voor elke sectie. De dichtheid en de vertakkingspunten van de dendritische stekels werden gemeten.
2.6. Immunohistochemie
Expressie van N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) subeenheden 2A en 2B in de hippocampus werd bepaald door immunohistochemie volgens de standaard procedure . De gebruikte primaire antilichamen waren konijn anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, China) en konijn anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China). Het secundaire antilichaam was HRP-geconjugeerd anti-konijn IgG (Servicebio).
2.7.
De morfologische veranderingen in de hippocampus werden gedetecteerd door TUNEL-kleuring met een commerciële kit (Roche, Mannheim, Duitsland) volgens de instructies. De secties ondergingen een DAB colorimetrische reactie gevolgd door hematoxyline kleuring. De kern van TUNEL-positieve apoptotische cellen werd bruin onder een lichtmicroscoop. Vijf secties werden geselecteerd voor elke rat en drie niet-repetitieve velden (400x vergroting) werden geselecteerd voor elke sectie. Het percentage TUNEL-positieve cellen in alle cellen werd berekend.
2.8. Western Blot
Het hippocampale CA1 hersendeel werd snel geëxtraheerd en in kleine secties gesneden volgens de hersenatlas. De hippocampus weefsels werden ’s nachts geïncubeerd met RIPA lysis buffer (met 100 Mm PMSF, gekocht bij Servicebio). De celresten werden verwijderd door centrifugatie gedurende 10 minuten om het supernatant met eiwit te verzamelen. De eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Eiwitlysaten (30 μg/lane) werden gescheiden door 10% SDS-PAGE en geëlektrobloteerd op PVDF-membraan. Na te zijn geblokkeerd met 5% vetvrije melk, werd het membraan ’s nachts gesondeerd met de volgende primaire antilichamen: konijn anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), konijn anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), konijn anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), konijn anti-ERα (1 : 2000, Millipore), konijn anti-fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), konijn anti-fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), konijn anti-Bax (1 : 1000, Abcam), konijn anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam), en konijn anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH werd gedetecteerd als interne controle. Vervolgens werd het membraan gedurende 1,5 uur gesondeerd met secundaire mierikswortelperoxidase-geconjugeerde geitenanti-rabbit IgG (1 : 5000, Bioworld). De gemiddelde optische dichtheid van de eiwitbanden werd gekwantificeerd met Image J software.
2.9. Statistische Analyse
De experimentele gegevens werden geanalyseerd met GraphPad Prism 5 software (San Diego, CA, USA). Numerieke gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Verschillen tussen twee groepen werden vergeleken door t-test. De resultaten van verborgen platform proef werden geanalyseerd door groep × dag repeated-measures ANOVA gevolgd door Tukey’s post hoc. Andere meervoudige vergelijkingen werden geanalyseerd door one-way ANOVA gevolgd door Tukey’s post hoc. waarde < 0.05 werd beschouwd als statistisch significant.
3. Resultaten
3.1. Xiao-Yao-San Decoction Improves Spatial Learning and Memory Abilities of Ovariectomized Rats
Learning ability was first assessed using the spatial acquisition trial. Repeated-measures ANOVA toonde aan dat zowel de behandeling en de trainingsdagen van invloed waren op de ontsnappingslatentie (Figuur 1(a)). De ontsnappingslatentie in alle groepen nam af met de toename van het aantal trainingsdagen (), en het verschil was ook significant in de trend van de latentiedaling binnen elke groep (). Er was geen interactie tussen behandeling en trainingsdagen (). Tijdens de eerste twee dagen van de training werd geen significant verschil waargenomen in de ontsnappingslatentie van elke groep. Vanaf de derde trainingsdag was de ontsnappingslatentie significant langer dan die van de sham groep; de ontsnappingslatentie van de E2 en hooggedoseerde XYS9 groep was korter dan die van de zoutoplossing groep, maar niet verschillend van die van de sham groep. Na 5 dagen van de opleiding, werden de ratten beoordeeld met de sonde proef om het ruimtelijk geheugen te testen. Zoals getoond in figuur 1 (b), de kruis tijden, duurtijd, en het percentage van de duurtijd in sonde kwadrant was aanzienlijk verminderd in de zoutoplossing groep. Geen verschil werd waargenomen in de duur tijd in andere kwadranten. Behandeling met XYS of E2 kon de kruis tijden en de duurtijd in de sonde kwadrant aanzienlijk herstellen tot het niveau van de sham groep. Om de effecten van omgevingsfactoren en cognitieve en activiteitsniveaus van proefdieren op ruimtelijk leren en geheugen uit te sluiten, ondergingen ratten ook de zichtbare platform proef (figuur 1(c)). Er was geen significant verschil in ontsnappingslatentie, zwemafstand, en zwemsnelheid tussen de groepen. Al met al suggereren deze resultaten dat het ruimtelijk leren en het geheugen bij OVX-ratten waren aangetast, en dat een hooggedoseerde XYS-behandeling de aangetaste cognitieve functies effectief kon verbeteren.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.2. Xiao-Yao-San Decoction Increases Hippocampal Estrogen Content in Ovariectomized Rats
Next, we bestudeerden het effect van XYS op oestrogeen niveau in OVX ratten. Zoals getoond in figuur 2 (a), verbeterde XYS behandeling niet het serum oestradiol niveau verminderd als gevolg van OVX; echter, er was geen significant verschil in serum oestradiol niveaus tussen de sham en OVX behandelingsgroepen. Van de nota, hoge dosis XYS en E2 verhoogde hippocampus oestradiol niveau in vergelijking met zoutoplossing (figuur 2 (b)). O-XYS3 groep had nog steeds lagere hippocampus oestradiol niveaus dan de sham groep. De verandering van de hippocampus E 2 gehalte kan niet worden verklaard door de verandering gonade-afgeleide E 2 inhoud, maar door de verandering van in situ synthese. Daarom detecteerden we de expressie van CYP19, het laatste enzym in oestrogeensynthese, in de hippocampus. De resultaten toonden aan dat behandeling met XYS of E2 de expressie van CYP19 kon verhogen in vergelijking met de zoutoplossing groep (), maar alleen het verschil tussen de hooggedoseerde XYS en zoutoplossing groepen was significant (). De behandeling herstelde het CYP19 niveau niet tot dat van de sham groep. De resultaten suggereren dat XYS de expressie van aromatase in de hippocampus bevordert, waardoor de de novo synthese van E2 toeneemt.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.3. Xiao-Yao-San Decoction Vermindert Neuronale Schade in de hippocampus van Ovariectomized Rats
Celmorfologie in de hippocampus, vooral in de CA1 regio, speelt een belangrijke rol in cognitief vermogen . De celmorfologie in de hippocampus werd geanalyseerd door Golgi kleuring, zoals getoond in figuur 3 (a). Vergeleken met de sham groep, daalde het aantal neuronen in de zoutoplossing groep aanzienlijk, en de morfologie van de dendritische stekels was beschadigd. Verdere analyse van CA1 neuronen toonde aan dat de punt aantal neuronen en dendritische stekel dichtheid aanzienlijk afgenomen in de zoutoplossing groep (Figuren 3 (b) en 3 (c)). Hoge dosis XYS behandeling verhoogde het aantal neuronen in de hippocampus en verhoogde het punt aantal neuronen en stekel dichtheid in de CA1 regio. E 2 behandeling had hetzelfde therapeutische effect als hoge dosis XYS. Echter, lage dosis XYS niet effectief verbeteren neuronale schade in de hippocampus CA1 regio. Consistent, werd de apoptose van hippocampus (CA1, CA3, DG) neuronen verminderd door een hoge dosis XYS of E2 behandeling (figuur 4). Echter, lage dosis XYS kon alleen verminderen de apoptose van CA3 neuronen, maar had geen effect op CA1 en DG neuronen. Alles bij elkaar genomen, kon hoge dosis XYS de neuronale schade in de hippocampus verminderen, vooral in de CA1 regio.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Xiao-Yao-San afkooksel verhoogt hippocampale expressie van NMDAR2A en NMDAR2B in ovariectomized ratten.
Synaptische plasticiteit is de neurobiologische basis voor lange-termijn leren en geheugen, en prestaties in de MWM-test wordt beïnvloed door NMDAR-functie . Daarom hebben we verder geschat de expressie van NMDAR subeenheden 2A en 2B in de hippocampale CA1. Western blot (Figuren 5(a) en 5(b)) toonde aan dat de expressie van NMDAR2A en NMDAR2B was verminderd in OVX ratten. Behandeling met XYS of E2 verhoogde het expressieniveau van deze twee eiwitten aanzienlijk tot hetzelfde niveau als dat in de sham groep. Immunohistochemie (Figuur 5 (c)) toonde ook aan dat het aandeel van positief gekleurde cellen toenam in de behandelingsgroepen. Vergeleken met de zoutoplossing groep, verhoogde hoge dosis XYS significant de expressie van zowel NMDAR2A en NDMAR2B ( en 0,013, resp.), maar lage dosis XYS kon alleen de expressie van NMDAR2A significant verhogen ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.4. Xiao-Yao-San Decoction Activates PI3K Signaling Pathway through ERα
De invloed van E2 of fyto-oestrogenen op de fysiologie wordt gemedieerd door ER-signalering. Studies hebben aangetoond dat de activering van extracellulair signaal-gereguleerd kinase (ERK), een mitogeen-geactiveerd eiwit kinase, noodzakelijk is voor de gunstige effecten van E2 op het geheugen. De fosforylering van ERK1/2 is afhankelijk van de activering van PI3K . Daarom onderzochten we het effect van XYS op ER-PI3K signalering. Zoals getoond in figuur 6, hoge dosis XYS en E2 aanzienlijk bevorderd de expressie van ERα, gefosforyleerde ERα (Ser118), en PI3K p110β (de katalytische subeenheid) in vergelijking met de zoutoplossing groep. Activering van ERα-PI3K verminderde verder de expressie van de pro-apoptotische factor Bax en verhoogde de expressie van de anti-apoptotische factor Bcl-2. Lage dosis XYS had echter geen significante invloed op de ERα-PI3K signalering, wat consistent is met de resultaten van figuren 3 en 4.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Discussie
XYS is al lang gebruikt voor de behandeling van perimenopauzale angst en depressie. Onze studie onderzocht de nieuwe toepassing van XYS in de behandeling van OVX-geïnduceerde cognitieve stoornissen. De resultaten toonden aan dat XYS effectief ruimtelijk leren en ruimtelijk geheugen verbeterde bij OVX ratten. Het mogelijke mechanisme is dat XYS de de novo synthese van oestrogeen in de hippocampus bevordert, waardoor de ERα-PI3K signaalroute wordt geactiveerd en de apoptose van hippocampale neuronen wordt geremd.
Het onderliggende mechanisme van XYS voor de behandeling van depressie is uitgebreid bestudeerd. XYS speelt een antidepressieve rol door het reguleren van een uitgebreid netwerk waarbij neurotransmitters, neurotrofines, hypothalamus-hypofyse-bijnier-as, aminozuren en lipiden betrokken zijn. Sommige van deze studies hebben aangetoond dat XYS kan inwerken op veranderingen in de hersenen die verband houden met stress. In vitro testen toonden aan dat een XYS-bevattend serum de verandering in mitochondriaal membraanpotentiaal, vrije calciumconcentratie, en apoptotische snelheid van neuronen geïnduceerd door oxidatieve stress kon omkeren. Onze studie toonde aan dat XYS ook neuronale apoptose in de hippocampus regio van OVX ratten verminderde. De anti-apoptotische effecten van XYS suggereren dat het de potentie had om in te werken op een verscheidenheid van pathologische processen die verband houden met neuronale apoptose in de hersenen.
De resultaten van onze studie toonden aan dat XYS het oestrogeenniveau in de hippocampus van OVX ratten kon herstellen. De hippocampus is essentieel voor geheugenvorming en is rijk aan ERs, en oestrogeen vergemakkelijkt een hogere cognitieve en synaptische gezondheid via deze ERs . Verschillende klinische studies wezen op de effectiviteit van hormoonvervangingstherapie op cognitieve symptomen gerelateerd aan oestrogeenverlies bij vrouwen. XYS kon het oestradiol niveau in de hippocampus verhogen, wat de cruciale basis zou moeten zijn voor zijn effectiviteit in het verbeteren van de cognitieve vaardigheden van OVX ratten. Echter, XYS verhoogde niet het serum oestradiol niveau. Dit kan zijn omdat oestradiol de novo gesynthetiseerd kan worden in de hippocampus, terwijl serum oestradiol afkomstig is van de gonaden. Onze resultaten toonden aan dat XYS de expressie van CYP19 in de hippocampus verhoogde, wat suggereert dat de verhoogde E2 in de hersenen waarschijnlijk afkomstig was van de hippocampus. De resultaten van onze studie toonden aan dat XYS de expressie van NMDAR2A en NMDAR2B in de hippocampus van OVX ratten verhoogde. Deze bevinding was consistent met eerdere studies. Oestrogeen bleek zowel de dichtheid van de dendritische wervelkolom als het aantal synapsen in de hippocampus te verhogen door de NMDAR functies bij OVX ratten te moduleren. Oestrogeen kon ook de morfologie van hippocampale neuronen herstellen in oude ratten door het NMDAR2B niveau te herstellen tot het niveau dat gezien wordt in jonge niveaus in de CA1 regio; wat meer is, oestrogeen kan de mobiliteit van NMDAR2A en NMDAR2B over de synaps beïnvloeden. Activatie van NMDAR zou op zijn beurt kunnen bijdragen aan de synthese van hippocampaal E2 door Ca2+ influx te induceren.
Naast NMDARs, kan XYS de expressie van andere cognitie-gerelateerde factoren in de hersenen reguleren. Verlies van postsynaptic density protein 95 (PSD-95), synaptophysin, en brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in de hippocampus is direct gecorreleerd met leer- en geheugentekorten. Het effect van XYS in CIS ratten is gerelateerd aan het bevorderen van de expressie van PSD-95 en synaptophysine in de hippocampus. XYS heeft ook aangetoond dat het BDNF in de frontale cortex, hippocampale CA1 regio, en amygdala van CIS ratten upreguleert. Tijdens het CIS behandelingsproces van XYS, werd de c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaalweg geremd in de hippocampus .
Hoewel we niet specifiek hebben onderzocht welke component de belangrijkste actieve is van XYS op leren en geheugen, suggereren onze resultaten dat de belangrijkste bron van fyto-oestrogenen in XYS een kandidaat is die verder onderzoek waard is. Het onderzoek van antidepressiva kan ons ook enkele aanwijzingen geven. Jiali Liu et al. ontdekten dat Bupleuri radix (Chaihu) het voornaamste antidepressivum is in het recept van XYS op basis van de serum farmacochemische analyse van de petroleumether fractie . In vitro studie toonde aan dat Bupleuri radix extract de proliferatie van neuroblastoom cellen bevorderde door activering van de PI3K/AKt pathway. De activering van PI3K werd ook waargenomen in onze studie.
De huidige klinische rapporten tonen aan dat XYS een significant antidepressief therapeutisch effect heeft, maar er is geen duidelijk toxicologisch onderzoek naar de toxiciteit en bijwerkingen van XYS in detail. In het algemeen kan XYS worden beschouwd als een recept zonder al te veel bijwerkingen. XYS heeft verschillende gewijzigde recepten, waarvan de basisingrediënten dezelfde zijn als XYS. Een recente meta-analyse beoordeelde de werkzaamheid en veiligheid van gemodificeerde XYS bij de behandeling van het perimenopauzale syndroom. De gepoolde resultaten suggereren dat gemodificeerde XYS effectiever en veiliger zou kunnen zijn voor de behandeling van het perimenopauzale syndroom in vergelijking met hormoonvervangingstherapie. Echter, vanwege de slechte methodologie van de geïncludeerde studies, moet de werkzaamheid en veiligheid van XYS meer rigoureuze studies ondergaan om bevestigd te worden. Met behulp van 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR) methode, meldde de onderzoeksgroep van Xiaoxia Gao dat de petroleumether fractie die lipofiele componenten bevat, de meest effectieve fractie was voor de behandeling van depressie . Zij rapporteerden ook dat Bupleuri Radix, het voornaamste antidepressieve bestanddeel, meer toxische effecten kon veroorzaken in de lever of de nieren van gezonde ratten dan bij ratten met chronische onvoorspelbare milde stress. De toxische effecten werden in verband gebracht met een verhoogde galzuurconcentratie, vergemakkelijking van de lysine-afbraak, en metabole verstoring van sfingolipide, glycerofosfolipide en vetzuren . Dit resultaat werd bevestigd in een recente metabolomische studie bij patiënten met depressie. XYS speelde een antidepressieve rol door de synthese van leucine, valine, en isoleucine en het metabolisme van binair zuur, vetzuur, argine, en proline te reguleren . Deze studies suggereren dat het noodzakelijk is om de status van de patiënt nauwlettend in de gaten te houden met tijdige aanpassing van de dosis om toxische bijwerkingen te voorkomen.
5. Conclusies
In deze studie toonden we aan dat hooggedoseerde XYS-behandeling een vergelijkbare werkzaamheid had als E2 in het verbeteren van de cognitieve vermogens van OVX-ratten. Het therapeutische effect werd gemediteerd door de bescherming van de hippocampale neuronen en het herstel van het hippocampale E2 niveau. ERα-PI3K signaling pathway was betrokken bij het proces. Onze studie suggereert dat XYS een optie zou kunnen zijn voor de behandeling van perimenopauzale cognitieve stoornissen. Op dit moment wordt XYS voornamelijk gebruikt bij de behandeling van klinische angst en depressie. Meer klinische gegevens zijn nodig om het effect op verbetering van de cognitieve functie te verifiëren.
Beschikbaarheid van gegevens
De gegevens die zijn gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen zijn op verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteurs.
Belangenconflicten
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten in welke vorm dan ook hebben.
Bijdragen van auteurs
Lina Liu en Fei Ge hebben gelijkelijk bijgedragen aan dit onderzoek.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795, en 81903974); de Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (Grant nr. BK20181235); het Jiangsu Provinciaal Bureau van Traditionele Chinese Geneeskunde (Grant nr. YB2017066); het Nanjing Science and Technology Development Plan Project (Grant nr. 201715072); het project van het ziekenhuis voor Chinese geneeskunde van de provincie Jiangsu (Grant nr. Y2018CX09); en een project gefinancierd door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.