De term Vlaamse schilderkunst verwijst naar werken die van de 15e tot de 17e eeuw werden vervaardigd in de streek die ongeveer samenvalt met het huidige België. In de 15e eeuw ontstonden daar schilderijen die kunstliefhebbers in heel Europa in vervoering brachten door het realisme van de details en de glans van de oppervlakken, bereikt door het nieuwe gebruik van olieverf. Aangezien Spanje en de oude Nederlanden vanaf het einde van de 15e eeuw onder de gezamenlijke heerschappij van de Habsburgers vielen, bevonden de Spaanse vorsten zich in een gunstige positie om schilderijen uit deze regio te verzamelen. Als gevolg hiervan bezit het Museo del Prado een van de beste en grootste collecties Vlaamse schilderkunst die er bestaan, met bijna 1000 werken.
Merkwaardig binnen de collectie 15e-eeuwse schilderkunst is De kruisafneming van Rogier van der Weyden (ca. 1399-1464), een van de grote canonieke werken uit de geschiedenis van de Europese kunst. Ook goed vertegenwoordigd in het Prado zijn Robert Campin (ca.1375-1444), Hans Memling (actief van 1465 tot 1494) en, in het begin van de 16e eeuw, Gerard David (ca.1460-1523) en Jan Gossaert (ca.1478-1532).
Hieronmyous Bosch, in Spanje bekend als El Bosco, is een van de schilders die de moderne museumbezoeker het meest fascineert door de opmerkelijke fantasiewereld die in zijn schilderijen te zien is en de satirische toon waarmee hij het menselijk gedrag bekritiseert. Enkele decennia na de dood van de kunstenaar werd Filips II de belangrijkste verzamelaar van zijn werken, wat verklaart waarom het Museo del Prado de beste en grootste collectie ter wereld heeft.
In de 16e en 17e eeuw werd Antwerpen een van de belangrijkste artistieke centra van Europa. Op de concurrerende kunstmarkt ontstonden de eerste bekende landschappen, geschilderd door Joachim Patinir (ca.1480-1524), en het Prado bezit vier van zijn belangrijkste werken. Ook actief in de 16e eeuw was de grote Pieter Brueghel de Oude (1552/30-1569), de schepper van de exquise en macabere Triomf van de dood en ook van De wijn van Sint Maarten, een van de belangrijkste aanwinsten van het museum in de afgelopen decennia.
De grote figuur van de 17e-eeuwse Vlaamse schilderkunst was Rubens (1577-1640), die de meest gevierde kunstenaar in Europa werd en ook de favoriete schilder was van zijn grote Spaanse opdrachtgever, Filips IV. Rubens maakte een sensueel en majestueus oeuvre geïnspireerd door de kunst uit de oudheid. Het Museo del Prado bezit de grootste collectie van zijn werken die er bestaat, ongeveer negentig schilderijen (afhankelijk van de aanvaarding of verwerping van één of twee toeschrijvingen). Van groot belang zijn ook de werken van andere Vlaamse kunstenaars uit de 17e eeuw, zoals Jan Brueghel de Oude (1568-1625), Jordaens (1593-1678) en Van Dyck (1599-1641).
De collectie Duitse renaissanceschilderkunst van het Prado is klein, maar van hoge kwaliteit. Zij omvat vier belangrijke schilderijen van Dürer (1471-1528), waaronder een zelfportret, en twee belangrijke jachttaferelen van Lucas Cranach de Oude (1472-1553).
De collectie Nederlandse schilderkunst uit de 17de eeuw is eveneens klein, als gevolg van de oorlog tussen de Spaanse monarchie en de noordelijke provincies van de Nederlanden in de tijd dat de koninklijke verzamelingen hoofdzakelijk werden bijeengebracht. Niettemin bezit het Prado een belangrijk schilderij van Rembrandt, Judith aan het banket van Holofernes, en een opmerkelijke groep landschappen van Jan Both (1618/22-1652) en Herman van Swanevelt (1603/4-1655), twee Nederlandse kunstenaars die in Rome werkten.