In deze studie stelden we de hypothese dat verschillende methoden van RNA isolatie de resultaten zullen beïnvloeden bij het analyseren van genexpressie in weefsels. RNA-extractiemethoden kunnen grofweg worden gekarakteriseerd in fenol:chloroformextractie gevolgd door alcoholprecipitatie (TRIzol), fenol:chloroform gevolgd door vastefase-extractie (kolom-gebaseerd; miRVana en miRNeasy) en vastefase-scheiding met/zonder affiniteitshars (Norgen total en Isolate II). Deze methodologieën zijn in de eerste plaats ontwikkeld voor de extractie van lange mRNA’s en zijn gebaseerd op de veronderstelling dat alle RNA’s gelijk worden gezuiverd. Bovendien zijn er een aantal overwegingen voor het kiezen van een bepaalde RNA-extractiemethode, zoals de kwaliteit, kwantiteit, prijs, en gebruiksgemak (tijd tot extractie). Hierin presenteren we gegevens waaruit blijkt dat de methode die wordt gebruikt om het RNA te extraheren zal ook variabele resultaten opleveren in vergelijking met verschillende methoden in downstream-toepassingen en is daarom een andere belangrijke overweging.
Deze studie toont aan dat RNA isolatie methoden variëren in termen van de kwantiteit en kwaliteit van RNA monsters, en in de analyse van miRNA en target genexpressie. Wij kozen organen die om verschillende redenen moeilijk kunnen zijn om RNA uit te isoleren. Bijvoorbeeld, RNA isolatie van de hersenen wordt vaak opgemerkt te resulteren in een lage opbrengst als gevolg van het hoge lipidegehalte. Dit was vooral duidelijk met de Bioline Isolate II kit. Het protocol van de fabrikant suggereert dat tot 5 ug RNA moet worden gezuiverd uit 10 mg van rat/muis hersenen. Het miRNeasy-handboek suggereert echter dat 5-20 μg RNA haalbaar zou moeten zijn uit hersenen met dezelfde hoeveelheid inputmateriaal. De probleemoplossing op de website van de fabrikant beschrijft een probleem met vetrijke weefsels, namelijk verstopping van de kolom, en stelt voor de hoeveelheid monster te verminderen of het volume van de lysisbuffer te vergroten. Onze extracties werden uitgevoerd binnen de voorgestelde grenzen van het protocol. Vervolgens wordt voorgesteld een pre-extractie uit te voeren met TRIsure-reagens (Bioline’s equivalent van TRIzol) en vervolgens een scheiding op kolom met de kit om de waterige fase op te schonen. Deze methode zou dan vergelijkbaar zijn met miRVana en miRNeasy RNA-extractiemethoden en kan resulteren in een betere opbrengst voor dit weefsel. Bovendien correleert de RNA-kwaliteit met weefselspecifieke reacties op fysiologische stress, zowel vóór als na het afsterven van het weefsel. Weefsels zoals long en lever hebben doorgaans lage RIN’s en een kleine 28S-piek, aangezien deze weefsels vatbaar zijn voor snellere afbraak van RNA door hoge nucleaseniveaus. Om nucleasen te inactiveren wordt het weefsel snel bevroren en wordt ontdooien voorkomen totdat het gewogen materiaal aan de extractiebuffer wordt toegevoegd. Hoewel dooi van het weefsel werd voorkomen, kunnen wij niet uitsluiten dat de tijd tussen euthanasie van het dier en excisie van de organen tot het snel invriezen heeft bijgedragen tot de algemeen lage RIN-waarden en enkele afbraakproducten die bij alle longmonsters zijn waargenomen, ongeacht de gebruikte isolatieset. Een alternatieve methode om nucleasen te inactiveren is het gebruik van een RNA-stabiliserende oplossing zoals RNAlater (ThermoFisher Scientific), waardoor niet-bevroren weefselmonsters later kunnen worden verwerkt. Het kan helpen zorgen voor de integriteit van het RNA, maar het is niet compatibel met alle RNA isolatie procedures en gebruikers moeten controleren hun specifieke methode voorafgaand aan het uitvoeren van extracties. De toevoeging van een piek na 60 s in sommige monsters in de Bioanalyser-analyse suggereert gDNA-verontreiniging. Een extra DNase-behandeling kan worden uitgevoerd op kolommen met sommige kits, maar een gDNA-eliminatiestap wordt ten zeerste aanbevolen tijdens de omgekeerde transcriptiestap. De opname van deze stap in onze methoden kan verklaren waarom er geen interferentie was bij de analyse van de mRNA-expressie van de longmonsters uit Norgen, maar het had wel invloed op de miRNA-expressieanalyse, aangezien het Taqman miRNA-testprotocol geen gDNA-verwijdering omvat. Verder is de zuiverheid van RNA-monsters een kritische factor, want hoewel monsters met RIN > 7 in de meeste downstream-toepassingen goed zouden moeten presteren, kunnen die waarbij enzymatische reacties optreden, zoals qPCR, worden geremd door nucleasen, metaalionen of organische contaminanten. In het algemeen hadden de Bioline Isolate II RNA-monsters lagere 260/230-verhoudingen en verontreinigingen kunnen bijdragen tot de slechte prestaties. Tenslotte werden verschillen waargenomen in de verrijking voor miRNA’s in het totale RNA preparaat. Aangezien miRNA’s een kleine fractie van het totale RNA-repertoire vertegenwoordigen, kan het moeilijk zijn hun bijdrage uit de integriteitsanalyse te bepalen. De Qubit-microRNA-test biedt een zeer selectieve detectie van kleine hoeveelheden kleine RNA’s, zelfs in de aanwezigheid van veel voorkomende verontreinigingen. Hoge percentages miRNA’s werden algemeen gedetecteerd met miRVana en Norgen extractiemethoden, maar gezien de integriteitsanalyse voor Norgen totaal RNA preparaten is het mogelijk dat de miRNA verrijking wordt overschat omdat kleinere RNA fragmenten worden gedetecteerd na degradatie of oxidatie van grotere RNA’s (mRNA’s, rRNA of tRNA’s) of in het geval van de longmonsters DNA-verontreiniging die de Qubit resultaten verstoort. Vandaar dat de kwantiteit, kwaliteit en zuiverheid van RNA monsters zijn zeer belangrijke factoren voor het kiezen van een bepaalde RNA extractiemethode en verder onderzoek naar hoe deze methoden te optimaliseren voor uw weefsel van belang kan helpen verbeteren these.
Profilering van miRNAs kan inzicht geven als biomarkers voor diagnostische of prognostische toepassingen. Zo kunnen panels van miRNA’s worden gebruikt om verschillende kankeren fenotypes te classificeren, recidief of respons op therapieën te voorspellen . Voor de ontdekking en klinische toepassing van op miRNA gebaseerde biomarkers moeten er echter geoptimaliseerde en gestandaardiseerde praktijken zijn voor de wijze waarop het RNA wordt geëxtraheerd om tegenstrijdige resultaten te voorkomen. In een meta-analyse van 63 gepubliceerde studies door Zhou et al. (2014) werden bijvoorbeeld inconsistente en zelfs tegenstrijdige resultaten gevonden bij de beoordeling van de prognostische waarde van de oncomiR, miR-21 . De auteurs schrijven de heterogeniteit toe aan verschillen in de bron van de monsters, de detectiemethoden en normalisatiemethoden, maar zinspeelden niet op de methoden voor het extraheren van RNA, waarvan wij laten zien dat ze ook bijdragen.
De biologische functies en doelen van zeer weinig miRNA’s zijn experimenteel gevalideerd, maar dit is van cruciaal belang om het potentieel van miRNA-gebaseerde therapie te realiseren. Bovendien zal het blootleggen van weefselspecifieke biologische functies helpen om hun therapeutische werking en mogelijke off-target effecten in normale weefsels te identificeren. Validatie van miRNA-mRNA interacties wordt voornamelijk uitgevoerd in celkweek assays, die kunstmatige manipulatie van endogene miRNAs impliceren. De niveaus die door middel van celcultuurmanipulatie (b.v. transfectie van mimics) worden bereikt, liggen echter meestal niet op de in vivo waargenomen fysiologische niveaus en daarom is het belangrijk de resultaten in geschikte diermodellen te recapituleren. Momenteel zijn er geen rapporten direct vergeleken miRNA en target gen detectie van totaal RNA monsters met behulp van verschillende extractiemethoden. Wij tonen aan dat RNA extractiemethoden verschillen in hun efficiëntie in het isoleren van zowel korte als lange RNA’s en dus zorgvuldige afweging moet gaan in het kiezen van een geschikte methode als u wilt detecteren zowel van hetzelfde monster.
Vorig onderzoek heeft algemeen aangenomen dat alle soorten RNA worden gezuiverd gelijk. Er zijn echter verschillende rapporten verschenen die wijzen op verschillen in extractie-efficiëntie, afhankelijk van de methode die wordt gebruikt voor RNA-isolatie. Kim et al. (2011) trokken hun artikel in Molecular Cell in omdat zij ontdekten dat hun conclusies over verschillen in miRNA-expressie van cellen die bij verschillende confluencies (hoge dichtheid versus lage dichtheid) werden gekweekt en wanneer zij van de kweekschaal werden losgemaakt (adherent versus suspensie) in feite werden verklaard door verschillen in RNA-extractie-efficiëntie bij gebruik van de TRIzol-methode . Zij ontdekten dat miRNA’s met een laag GC-gehalte en een stabiele secundaire structuur verloren gingen tijdens de extractie, in plaats van te worden afgebroken in de cellen zoals zij aanvankelijk hadden gepubliceerd . Eerdere resultaten van El-Khoury et al. (2016) vonden verschillen in miRNA herstel uit cellen, plasma en urine/plasma-afgeleide exosomen bij het vergelijken van TRIzol LS, miRNeasy serum/plasma en miRCURY biofluïd extractie kits . De auteurs vonden dat de miRCURY kit zeer zuiver RNA isoleerde maar miRNAs slecht terugwonnen, TRIzol een lage zuiverheid RNA opleverde wat de PCR efficiëntie beïnvloedde, terwijl miRNeasy een slechte kwaliteit RNA opleverde maar het best presteerde voor miRNA detectie. Ook McAlexander et al. (2013) vonden verschillen in miRNA-extractie uit plasma en cerebrospinaal vocht. Zij vergeleken miRVana, miRCURY Cell and Plant kit en TRIzol LS extracties met en zonder glycogeen als drager. miRVana was vergelijkbaar met of zonder glycogeen, terwijl miRCURY zonder glycogeen een iets lagere miRNA recovery had dan miRVana. Glycogeen verbeterde echter aanzienlijk de miRNA recovery met de miRCURY kit, maar verergerde de lage opbrengst en variabiliteit met TRIzol extractie. Vervolgens vergeleken zij de miRCURY Cell and Plant kit met de miRCURY Biofluids en miRNeasy serum/plasma extractiemethoden met glycogeen als drager en ontdekten dat miRCURY Biofluids de hoogste relatieve abundantie van gespiked-in exogeen miRNA had en concludeerden dat dit de superieure methode was voor hun specifieke toepassing. Collectief, deze studies wijzen op de verschillen in RNA herstel met behulp van verschillende extractiemethoden en suggereren de noodzaak om te optimaliseren voor uw cel, weefsel en / of vloeistof van belang.
Er zijn verschillende stappen tijdens de work-flow die experimentele variatie kan introduceren. Beginnend met de methode voor het fixeren of bevriezen van het weefsel, de opslag van het materiaal, RNA-extractie methode, methode gebruikt voor omgekeerde transcriptie en qPCR amplificatie of andere downstream-platforms. In deze studie hebben we geprobeerd om controle voor een aantal van deze variabelen door flash-vriezen van de weefsels, opslag bij – 80 ° C, het voorkomen van ontdooien voor extractie en met behulp van de meest aanbevolen praktijken voor miRNA expressie-analyse. Zo is gebleken dat het gebruik van sequentiespecifieke RT-primers in tegenstelling tot een universele RT-primer superieur is voor specifieke productamplificatie. qPCR wordt beschouwd als de gouden standaard voor de analyse van miRNA- en doelexpressie wegens zijn gevoeligheid en specificiteit ten opzichte van platforms voor globale profilering. Belangrijker is dat de kwaliteit van de verkregen resultaten belangrijker is dan het aantal miRNA’s dat door grote sequencing-platforms wordt geprofileerd. Bovendien, hoewel we niet het effect van miRNA verrijking van onze RNA monsters vorige rapporten hebben geadviseerd tegen het, met name voor de wereldwijde miRNA profilering platforms vergelijken. Bijvoorbeeld, Redshaw et al. (2013) gevonden dat de korte RNA verrijking procedure resulteert in aanzienlijk minder relatieve miRNA niveaus bij het vergelijken van totaal RNA en verrijkt materiaal, in het bijzonder de verrijking procedure verminderde het aantal kopieën van miRNAs tot 25% van die aanwezig zijn van pre-verrijkt monsters en dat dit verlies varieerde voor verschillende miRNA sequenties. Daarom kunnen miRNA-gegevens van totaal en kort RNA preparaten niet direct vergelijkbaar zijn. Bovendien is gesuggereerd dat grotere RNA kan fungeren als een drager voor kleine RNA’s. Of met miRNA verrijkte methoden voor alle bedrijven tot een betere recuperatie uit weefsels zouden leiden, moet nog worden bepaald. Hoewel Bioline een afzonderlijke kit voor miRNA-isolatie voorstelt, hebben wij de Isolate II total RNA-kit gebruikt om rechtstreeks te vergelijken met andere extractiemethoden, aangezien de miRNA-specifieke kit geen isolatie van zowel korte als lange RNA’s uit dezelfde elutie mogelijk maakt. In plaats daarvan worden de miRNA soorten verrijkt en eerst geïsoleerd, en vervolgens kunnen lange RNA’s worden geëxtraheerd, wat resulteert in twee afzonderlijke fracties. Hoewel de Isolate II niet geoptimaliseerd is om kleine RNA’s te isoleren zoals de miRVana of miRNeasy kits, was deze ook niet superieur voor de expressie van het doelgen. Gezien het grote verschil tussen bepaalde kits zouden onderzoekers moeten kiezen voor een meer robuuste extractiemethode.