The function of chaperone proteins in the assemblage of protein complexes involved in gamete adhesion and fusion processes

Multiprotein complexes in spermacapacitatie en ZP-interactie

Bij het bereiken van de plaats van bevruchting, de ampulla, moeten spermatozoa twee barrières passeren voordat ze samensmelten met het plasmamembraan van de oöcyt, of oolemma. De eerste barrière is een hyaluronzuurrijke laag van cumuluscellen die de oöcyt omgeven, en de tweede barrière is de extracellulaire matrix van de oöcyt zelf, de ZP (Hartmann et al. 1972). Ondanks de ontwikkeling van bindingsplaatsen voor zowel ZP als hyaluronzuur tijdens de spermatogenese en de verwerving van bindingspotentieel naarmate de spermatozoa de epididymis passeren, moeten deze cellen een aparte verblijfsperiode in het vrouwelijke voortplantingskanaal doorbrengen voordat zij met succes aan dergelijke interacties kunnen deelnemen (Austin 1951, Chang 1951). De collectieve veranderingen die spermatozoa in deze omgeving ondergaan, de zogenaamde capacitatie, stellen de cellen in staat om te reageren op signalen afkomstig van het cumulus oocyte complex en een proces van acrosomale exocytose te voltooien, waardoor ze geschikt worden voor fusie met het oolemma.

Het ZP bestaat uit een reeks sulfoglycoproteïnen, namelijk ZP1, ZP2 en ZP3, die in de meeste zoogdiersoorten sterk geconserveerd zijn (hoewel een extra ligand, ZP4/B, is gerapporteerd in menselijke en varkensocytose) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Algemeen wordt aangenomen dat deze liganden de binding van sperma in de meeste soorten bepalen (zie ook Reid et al. (2011)). Opmerkelijk is echter dat er momenteel nog verschillende modellen worden bestudeerd met betrekking tot de identiteit van de primaire spermareceptor binnen het ZP en de mechanismen waarmee spermatozoa zich aan deze matrix hechten (zie ook Visconti & Florman (2010)). Onderzoek naar de identiteit van de corresponderende receptor(en) op het spermaoppervlak die de juiste ligand(en) op de ZP herkennen, heeft evenmin definitieve antwoorden opgeleverd. Er is immers een groeiende literatuur van knock-outs bij muizen van veelbelovende receptoreiwit-kandidaten (met inbegrip van β-1,4-galactosyltransferase (GALT1), arylsulfatase A (ARSA), en sperma adhesie molecule 1 (SPAM1); voor een volledige lijst, zie Ikawa et al. (2010)) die elk niet resulteren in volledige onvruchtbaarheid (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Integendeel, er worden verschillende gradaties van verminderd bindingsvermogen waargenomen, wat de mogelijkheid oproept dat dit proces een zekere mate van functionele redundantie inhoudt en dat een aantal sperma-eiwitten in overleg optreden om de ZP adhesie te mediëren. De coördinatie van de activiteit van deze eiwitten om produktieve ZP interacties te verzekeren wordt dus een belangrijk aandachtspunt in het onderzoek.

In de meeste eutherische zoogdieren wordt verondersteld dat de capacitatie van het sperma in gang wordt gezet door de activering van een cAMP-gemedieerde route die culmineert in de tyrosine fosforylering van meerdere sperma-eiwitten (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Moleculaire chaperones spelen een belangrijke rol in deze reeks eiwitten, waarbij HSP90AA1, HSP90B1 en HSPD1 tot de eiwitten behoren die tyrosine fosforylering vertonen als gevolg van capacitatie (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). De huidige modellen suggereren dat de fosforylering van deze chaperones tijdens de capacitatie hun actieve rol in de assemblage van ZP herkenningseiwitten tot complexen en/of de translocatie van deze complexen naar het oppervlak van spermatozoa ter voorbereiding van de bevruchting activeert (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Naast deze indirecte rol in de gametenadhesie hebben chaperones van het spermaoppervlak ook functies als adhesiemoleculen die de herkenning van sulfoglycolipiden bemiddelen tijdens de gametenbinding (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Recentelijk is de techniek van blauwe natieve PAGE (BN-PAGE), die oorspronkelijk werd ontwikkeld voor de analyse van multienzymcomplexen van de elektronentransportketen (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), aangepast voor de beoordeling van multimerische sperma-oppervlakcomplexen bij muizen en mensen (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Deze techniek maakt de elektroforetische resolutie mogelijk van natieve eiwitcomplexen die hun biologische activiteit behouden. In menselijke en muis spermatozoa heeft het gebruik van BN-PAGE in parallel met Far-Western blotting met hele gesolubiliseerde zonae verschillende primaire multiproteïne complexen onthuld die affiniteit bezitten voor homoloog ZP (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Een dergelijk complex zou bestaan uit de eiwitcomponenten van het CCT/TRiC-complex (CCT1-CCT8), een dubbelringstructuur die functioneert als een moleculaire chaperon met een sleutelrol bij het reguleren van de vorming van multiproteïnecomplexen (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Verondersteld bewijs in de vorm van co-immunoprecipitatie, co-lokalisatie en proximity ligatie assays heeft ZP bindend eiwit 2 (ZPBP2) geïdentificeerd als een van de meest overtuigende client-eiwitten voor het CCT/TRiC complex in rijpe spermatozoa (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Oorspronkelijk werd ZP betrokken bij de secundaire ZP binding, maar een recentere studie heeft aangetoond dat mannelijke muizen die nihil zijn voor ZPBP2 subfertiel zijn en defecten vertonen in ZP interactie en penetratie (Lin et al. 2007). Bij muizen zijn er aanvullende aanwijzingen dat bepaalde CCT/TRiC complex subeenheden naar het spermaoppervlak worden getranslokeerd tijdens spermacapacitatie (Dun et al. 2011).

Een andere prominente klasse van chaperones die op het spermaoppervlak is geïdentificeerd en betrokken is bij de regulatie van ZP interacties is de HSP70 familie (Naaby-Hansen et al. 2010). Net als bij het CCT/TRiC complex, hebben de chaperones van de HSP70 familie ook goed gedocumenteerde rollen in het vergemakkelijken van zowel transmembraan eiwittransport als assemblage van stabiele eiwitcomplexen (Mayer & Bukau 2005). Een lid van de HSP70 familie dat uitsluitend (muis) of overheersend (mens) tot expressie komt in de testes lijkt essentieel te zijn voor de mannelijke vruchtbaarheid. Een afwijkende expressie van dit chaperon, HSPA2, is gecorreleerd met een fenotype van ernstige mannelijke onvruchtbaarheid bij de mens, waarbij specifiek het vermogen van spermatozoa om te interageren met homologe oöcyten in vitro wordt aangetast (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Zowel bij muizen als bij mensen speelt HSPA2 een fundamentele rol in de spermatogenese; gerichte deletie van het eiwit bij de eerstgenoemde soort leidt tot een vroege stopzetting van dit proces en een daarmee gepaard gaande afwezigheid van spermatozoa (Eddy 1999). Bij de mens is het expressieniveau van HSPA2 positief gecorreleerd met het succes van in vitro bevruchting (Huszar e.a. 2000, 2006, Cayli e.a. 2003) en is derhalve naar verluidt in staat om de vruchtbaarheidstoestand van mannen met een hoge mate van nauwkeurigheid te voorspellen (Ergur e.a. 2002).

Karakterisering van HSPA2 in ons eigen laboratorium heeft aangetoond dat dit chaperon aanwezig is in het acrosomale domein van menselijke spermatozoa en een component is van ten minste vijf eiwitcomplexen met hoge molecuulmassa (Redgrove et al. 2012), waaronder een subset van die waarvan eerder is aangetoond dat ze ZP-affiniteit bezitten (Redgrove et al. 2011). In overeenstemming met deze gegevens hebben wij bewijs verzameld dat de meest dominante van de HSPA2 complexen twee extra eiwitten bevat, die beide eerder betrokken zijn geweest bij sperma-zona interacties (Redgrove et al. 2012). Bovendien hebben wij, in overeenstemming met de gepubliceerde resultaten van Huszar et al., een significante vermindering kunnen aantonen van de HSPA2 niveaus in de spermatozoa van mannen met geïsoleerde laesies in hun vermogen om interacties aan te gaan met ZP van homologe oöcyten in vitro (Redgrove et al. 2012). Ons huidige werk richt zich op de vraag of het tekort aan ZP-adhesie het gevolg is van een afwijkende vorming van ZP-bindingsplaatsen in de vroege stadia van spermiogenese (Huszar et al. 2000) of het gevolg kan zijn van het onvermogen van HSPA2 om deel te nemen aan de remodellering van het spermaoppervlak tijdens de capacitatie, zoals het vergemakkelijken van de assemblage en/of presentatie van ZP-receptoren op het spermaoppervlak als voorbereiding op ZP-interactie.

Naast ons eigen werk aan de assemblage van sperma-oppervlak complexen, hebben Han et al. onafhankelijk een alternatief chaperon-laden multiproteïne complex op het oppervlak van muis spermatozoa geïdentificeerd. Het is interessant dat, zoals hierboven beschreven, dit complex, bestaande uit HSPA5, calnexine, integraal membraaneiwit 2B, en ADAM7, blijkbaar geassembleerd wordt tijdens de capacitatie (Han et al. 2011). Hoewel de functie van dit complex nog niet volledig is opgehelderd, is de expressie van ADAM7 in verband gebracht met de aanwezigheid van andere ADAM-eiwitten, ADAM2 en ADAM3 (Kim et al. 2006), die belangrijk zijn voor de adhesie van spermatozoa aan de ZP (Muro & Okabe 2011). Bovendien is bekend dat HSPA5 betrokken is bij de bevordering van de adhesie van hoogwaardige spermatozoa aan oviductale epitheelcellen (OEC) in de isthmus van het vrouwelijke voortplantingskanaal. Van de vorming van dit reservoir wordt verondersteld dat het pro-overlevingseffecten heeft in de zin dat het sperma in een niet-gecapaciteerde, rustige toestand wordt gehouden ter voorbereiding van de vrijlating van de eicel in de ampulla (Topfer-Petersen et al. 2002). Interessant is dat de chaperones HSPD1 en HSPA5 ook gelokaliseerd zijn op het oppervlak van runder-OSEC en dus betrokken zijn bij de binding van sperma en OEC (Boilard et al. 2004).

Ook in overeenstemming met ons eigen werk is aangetoond dat het door Han et al. werd aangetoond dat het zich bevindt in membraan microdomeinen of lipide rafts, gespecialiseerde gebieden van het membraan die een platform bieden voor de functionele assemblage en presentatie van multiproteïne complexen (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). De partitionering van chaperoncomplexen in het raftmilieu is ook waargenomen voor HSPA2 in menselijke spermatozoa (Nixon et al. 2011) en voor componenten van het CCT/TRiC complex in muis spermatozoa (Dun et al. 2011). Deze membraandomeinen omvatten ook een aantal andere vermeende ZP-receptoreiwitten, waaronder GALT1, ZP3R en SPAM1, wat hun rol in de remodellering van het spermaoppervlak en in ZP-binding versterkt (Fig. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Het mechanisme (of de mechanismen) waarmee dergelijke eiwitten worden gerekruteerd in de lipide rafts zijn nog niet opgelost; HSPA2 is echter gemeld om zich via zijn ATPase domein te binden aan 3′sulfogalactosylglycerolipide, de belangrijkste glycoproteïne geïdentificeerd binnen sperma lipide rafts (Mamelak & Lingwood 2001).

Naast de vermeende rol van lipide rafts bij de herpositionering van belangrijke chaperoncomplexen en ZP-receptoreiwitten, is er ook overtuigend bewijs dat veel vermeende ZP-receptoren, zoals ARSA en ZP3R, evenals verschillende moleculaire chaperones een capacitatie-afhankelijke verplaatsing vertonen van intracellulaire plaatsen zoals het acrosoom naar het spermaoppervlak om de cellen voor te bereiden op hun interacties met het ZP (Nixon et al. 2009). Er is voorgesteld dat het intieme contact tussen het buitenste acrosomale membraan en het plasmamembraan van het sperma tot stand komt door de binding van complementaire oplosbare N-ethylmaleïmide-gevoelige factor attachment protein receptor (SNARE)-eiwitten, wat leidt tot de vorming van fusieporiën die een route vormen voor de migratie van enzymen naar het spermaoppervlak vóór het volledige verlies van de acrosomale inhoud (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). Ter ondersteuning van dit model toonde een studie van Brahmaraju et al. (2004) aan dat toediening van antilichamen tegen VAMP en SNAP in het acrosomale blaasje de binding van sperma-ZP in de muis remde.

Deze progressieve priming van het sperma-oppervlak heeft vragen doen rijzen over de alles of niets aard van acrosomale exocytose. Niettemin blijkt de functionele assemblage van SNARE complexen ook ten grondslag te liggen aan de langdurige sperma membraanfusie gebeurtenissen die een volledig verlies van de acrosomale inhoud mogelijk maken (Tsai et al. 2010). Hoewel algemeen wordt aangenomen dat contact met de ZP deze acrosomale exocytose initieert bij de meeste zoogdiersoorten, hebben een aantal studies uitgevoerd in de muis aangetoond dat spermatozoa die beginnen met acrosomale exocytose vóór contact met de ZP nog steeds in staat zijn om de oöcyt te bevruchten (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Dit fenomeen kan ook gelden voor spermatozoa van cavia’s (Huang et al. 1981) en hamsters (Yanagimachi & Phillips 1984). Dergelijke bevindingen suggereren een belangrijke rol voor de cumulus oophorus in de initiatie van de acrosoomreactie en wekken bezorgdheid over het vermogen van in vitro studies uitgevoerd met cumulus-ontlede oöcyt zona structuren om nauwkeurig te rapporteren over de ware aard van de acrosoomreactie en inderdaad ZP interactie.

Niettegenstaande deze controverse, zijn chaperon-achtige moleculen ook betrokken bij acrosomale exocytose op grond van hun vermogen om de assemblage van glutamine-bevattende SNAREs (Q-SNAREs) en arginine-bevattende SNARES (T-SNAREs) te bevorderen tot hechte ternaire complexen (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Interessant is dat elegante studies bij varkens hebben aangetoond dat capacitatie een stabiele koppeling induceert van de spermaplasmamembraan met de buitenste acrosomale membraan ter voorbereiding van de bevruchting (Tsai et al. 2010). Recentere studies, uitgevoerd door Tsai et al. (2012), hebben ook bewijs geleverd voor de aanwezigheid van unilamellaire gemengde blaasjes die, naast andere belangrijke functies, de rekrutering van secundaire ZP-bindende eiwitten aan het spermaoppervlak mogelijk maken en een nieuw trimerisch SNARE-complex bezitten dat bestaat uit syntaxine 3, SNAP23, VAMP2, en een bijkomend eiwit, complexine 2. De energie die vrijkomt bij de vorming van dergelijke complexen wordt op zijn beurt gebruikt om membraanfusie op gang te brengen door het plasmamembraan en het binnenste acrosomale membraan van de spermatozoïde naar elkaar toe te trekken (Tomes et al. 2002). De voltooiing van dit proces is van cruciaal belang voor de blootstelling van spermadomeinen die deelnemen aan de stroomafwaartse gebeurtenissen van de bevruchting: oolemembinding en fusie.