shRNA – Toepassingen – Wat is shRNA, hoe werkt het en wat zijn de toepassingen?

Wat is shRNA en hoe gebruik je het?

Short hairpin RNA (shRNA)-sequenties worden gewoonlijk gecodeerd in een DNA-vector die via plasmidetransfectie of virale transductie in cellen kan worden ingebracht. shRNA-moleculen kunnen op basis van hun ontwerp in twee hoofdcategorieën worden onderverdeeld: eenvoudige stam-lus en microRNA-aangepaste shRNA. Een eenvoudige stam-lus shRNA wordt vaak getranscribeerd onder de controle van een RNA Polymerase III (Pol III) promotor. Het 50-70 nucleotide transcript vormt een stam-lus structuur bestaande uit een 19 tot 29 bp regio van dubbelstrengs RNA (de stam) overbrugd door een regio van overwegend enkelstrengs RNA (de lus) en een dinucleotide 3′ overhang . Het eenvoudige steel-loop shRNA wordt in de kern getranscribeerd en komt in de RNAi-route terecht, vergelijkbaar met een pre-microRNA. De langere (> 250 nucleotide) microRNA-aangepaste shRNA is een ontwerp dat meer lijkt op natieve pri-microRNA-moleculen, en bestaat uit een shRNA-stamstructuur die microRNA-achtige mismatches kan bevatten, overbrugd door een lus en geflankeerd door 5′ en 3′ endogene microRNA-sequenties . De aan microRNA aangepaste shRNA wordt, net als de eenvoudige steel-loop hairpin, ook in de kern getranscribeerd, maar wordt geacht eerder de RNAi-route in te gaan, vergelijkbaar met een endogeen pri-microRNA.

shRNA-technologieën zijn op DNA gebaseerd, wat flexibiliteit biedt in het ontwerp van de vector. De meeste vector-gebaseerde shRNA-systemen bevatten een selecteerbare marker om de eliminatie van cellen die niet met succes zijn getransfecteerd of getransduceerd, en het onderhoud van cellen met aanhoudende gen knockdown mogelijk te maken. De shRNA-expressiecassettes kunnen ook worden opgenomen in virale vectorsystemen, waaronder retrovirus, adeno-geassocieerd virus, adenovirus en lentivirus, die een stabiele integratie in en expressie vanuit het gastheergenoom mogelijk maken. Deze virale strategieën maken het mogelijk shRNA toe te dienen aan cellijnen die ongevoelig zijn voor transfectie. Fluorescente markers (zoals een groen of rood fluorescerend eiwit) kunnen ook worden opgenomen voor het volgen van cellen die shRNA’s tot expressie brengen. De prestaties van shRNA worden beïnvloed door vele factoren, waaronder de efficiëntie van de transductie of transfectie, de promotor die de expressie van de shRNA aanstuurt en epigenetische modificaties (die kunnen leiden tot het uitschakelen van de shRNA-expressie). Verder kan de invloed van elk van deze factoren op de vectorprestaties verschillen, afhankelijk van de cellijn of het celtype. SMARTchoice promotor- en reporteropties zijn beschikbaar om onderzoekers te helpen de optimale promotors voor shRNA-expressie en het uitschakelen van genen te selecteren. Tenslotte, wanneer deze shRNA expressie cassettes zijn gekoppeld aan induceerbare promotors, zoals met SMARTvector Induceerbare Lentiviral shRNA of de TRIPZ vector systeem, kunnen onderzoekers studies ontwerpen om tijdelijk en ruimtelijk moduleren genexpressie .

Video animatie: RNA-interferentie

Hoe wordt shRNA aan een cel toegediend?

Er zijn twee mogelijkheden voor op DNA gebaseerde shRNA toediening aan cellen. Voor plasmiden, typische transfectie methoden zoals het gebruik van lipide transfectie reagentia of elektroporatie kan worden gebruikt. Lentivirale deeltjes zijn een uitstekende keuze voor moeilijk te transfecteren cellen, en in situaties waarin een hoge efficiëntie nodig is of meerdere constructen per cel moeten worden geleverd. De meeste moderne vectoren hebben selecteerbare markers die het selectief doden van cellen in de cultuur die niet met succes werden getransfecteerd of getransduceerd mogelijk maken, zodat een zuivere cultuur kan worden ontwikkeld.

Wat beïnvloedt shRNA functie en specificiteit?

Optimale gen knockdown is een vereiste voor succesvolle RNAi met behulp van shRNA systemen. Rationeel ontwerp van shRNA-sequenties is grotendeels gebaseerd op algoritmen die zijn ontwikkeld met siRNA. Terwijl sommige siRNA ontwerpregels van toepassing zijn op shRNA, zullen meer verfijnde shRNA ontwerpalgoritmen waarschijnlijk de doelgen silencing voor shRNAs in de toekomst verbeteren. Om functionele shRNA-sequenties te voorspellen, selecteert Dharmacon’s SMARTvector™ shRNA-algoritme doelsequenties op basis van talrijke criteria, waaronder positie-afhankelijke nucleotidevoorkeuren, secundaire structuur en thermodynamische stabiliteitsprofielen die specifiek zijn voor de SMARTvector microRNA-gebaseerde scaffold. Bovendien is de SMARTvector algoritme omvat verschillende criteria voor het verhogen van specificiteit.

Net als bij siRNA’s, kunnen bio-informatica benaderingen worden toegepast op doel-specifieke shRNA’s te creëren, terwijl het minimaliseren van het potentieel voor off-target effecten. Hoge concentraties van silencing tussenproducten zijn bekend bij te dragen tot off-target gebeurtenissen, maar het niveau van de tussenproducten zijn moeilijk te controleren wanneer shRNAs exogeen tot expressie komen. Verschillende publicaties hebben gedocumenteerd bewijs dat, onder specifieke omstandigheden, hoge niveaus van eenvoudige stam-loop shRNA expressie kan verzadigen de endogene RNAi pathway, en leiden tot onbedoelde fenotypen. Andere studies hebben gesuggereerd dat het gebruik van een microRNA-aangepaste shRNA kan cellulaire toxiciteit voor in vivo RNAi experimenten te verminderen als gevolg van deze steigers efficiënter worden verwerkt door zowel Drosha-DGCR8 en Dicer .

shRNA toepassingen

shRNA biedt de mogelijkheid van langdurige gen silencing. Transductie van virale-gebaseerde shRNA maakt toegang tot cellen, zoals primaire en neuronale cellen, die moeilijk te transfecteren door de traditionele kationische lipide-gebaseerde strategieën. Op virussen gebaseerde shRNA’s zijn ook gebruikt om de genfunctie op het hele genoom schaal met behulp van pools van silencing constructs te evalueren. Pooled of arrayed schermen worden nu op grote schaal gebruikt om high-throughput schermen uit te voeren om genen die nodig zijn in een verscheidenheid van processen, zoals kanker cel overleving en proliferatie, tumor suppressor pathway componenten, modulatoren van de zoogdieren circadiane klok, onderdrukkers van epitheliale mesenchymale overgang, gastheer mediatoren van HIV-1 replicatie, en regulatoren van cel migratie te identificeren. De kracht van gepoolde RNAi-screening is ook uitgebreid tot screening op genfunctie in diermodellen om in vivo biologie te onderzoeken.

Welke shRNA tool is geschikt voor uw behoeften?

shRNA Selectiegids

Wij bieden een selectie van shRNA reagentia en bibliotheken. Deze snelle selectiegids helpt u bij het bepalen van de beste optie voor uw specifieke behoeften.

Geavanceerde producten

shRNA – Producten

• Lentivirale vector-gebaseerde reagentia voor RNA interference.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Maak slimme, weloverwogen keuzes voor succesvolle gene silencing in uw cellen van belang.

SMARTvector Induceerbare shRNA

• De meest geavanceerde en flexibele single-vector induceerbare shRNA beschikbaar voor strak gecontroleerde gen silencing.

Pooled Lentiviral Screening Libraries

• Geoptimaliseerde constructie van hoge kwaliteit pools, complete analyse tools, en gevalideerde protocollen zijn essentieel voor een succesvol resultaat bij screening met pooled lentiviral libraries.

Featured Resources

shRNA – Resources

• Vind productgidsen, FAQ’s en meer.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Technische notitie die de SMARTchoice shRNA experimentele workflow beschrijft in suspensiecellen.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technische handleiding

• Het platform is een innovatief systeem bij uitstek geschikt voor RNAi-gemedieerde studies.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Experimentele protocollen voor gen knockdown met behulp van GIPZ lentiviral shRNA.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nature Reviews, Moleculaire Celbiologie 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Stabiele onderdrukking van genexpressie door RNAi in zoogdiercellen. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Effectieve expressie van klein interfererend RNA in menselijke cellen. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Functionele analyse van verschillende promotors in lentivirale vectoren in verschillende stadia van in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentivirale vectoren voor verbeterde genexpressie in menselijke hematopoietische cellen. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-like family of transcription factor 9, a differentiation-associated transcription factor, suppresses Notch2 signaling and inhibits glioblastoma-initiating stem cells. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji coordinates control of PRC2 enzymatic activity and target gene occupancy in pluripotent cells. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Cytoplasmatisch FANCA-FANCC complex interageert en stabiliseert het cytoplasma-gedislokaliseerde leukemische Nucleophosmin Protein (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Functionele identificatie van geoptimaliseerde RNAi triggers met behulp van een massaal parallelle sensor assay. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/ short hairpin RNA pathways. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC couples microRNA biogenesis and post-transcriptional gene silencing. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Zeer parallelle identificatie van essentiële genen in kankercellen. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Science 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Candidate biomarkers of response to an experimental cancer drug identified through a large-scale RNA interference genetic screen. Klinisch Kankeronderzoek 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genen en Ontwikkeling 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 is een negatieve regulator van epitheliale-mesenchymale transitie en metastase in borstkanker. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) A genome-wide short hairpin RNA screening of jurkat T-cells for human proteins contributing to productive HIV-1 replication. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac function and survival during heart failure. Circulation 124(14):1537-1547.