Positieve functionele synergie van structureel geïntegreerde kunstmatige eiwitdimeren geassembleerd door Click chemistry

Click chemistry interface sites

We veronderstelden dat gebieden van het oppervlak van een eiwit die compatibel zijn in termen van associatie meer kans hebben om een geïntegreerde structuur te genereren door de vorming van wederzijds compatibele niet-covalente interacties. Aangezien de proteïnen monomeer zijn, zijn deze interacties in het beste geval zwak en van voorbijgaande aard, zodat ze niet blijven bestaan, redeneerden we dat we een moleculaire “bout” nodig hadden als onderdeel van de interface site om nieuwe interacties te bevorderen en te stabiliseren. De eerste stap is het identificeren van regio’s op de doeleiwitten die het inherente potentieel hebben om te interageren. ClusPro 2.040 (cluspro.org) werd gebruikt om potentiële dimer configuraties te genereren. De output sfGFP homodimer modellen werden verfijnd, geanalyseerd en gerangschikt met behulp van RosettaDock41,42 (Supplementary Table 1). De hoogst gerangschikte configuratie wordt getoond in Fig. 1b (dat is het dichtst model om de bepaalde structuur hieronder; vide infra), met de volgende 4 gerangschikte configuraties getoond in aanvullende Fig. 1. Terwijl verschillende oriëntaties van een sfGFP naar de andere werden waargenomen, docking bleek residuen 145-148, 202-207 en 221-224 werden routinematig gevonden om bij te dragen aan de dimer interface. Om de twee eiwitten aan elkaar te bouten werd gebruik gemaakt van genetisch gecodeerde bioorthgonale Click chemie (Fig. 1a). Het voordeel ten opzichte van bijvoorbeeld disulfide koppelingen zijn langere zijketens om potentiële sterische botsingen te overwinnen, verbeterde crosslink stabiliteit en de mogelijkheid om niet-symmetrische (verschillende koppelingsresiduen op verschillende monomeren) en heterodimeren te genereren op een ontworpen 1-op-1 manier (vide infra).

Op basis van de dimermodellen werden drie residuen geselecteerd voor vervanging door de twee Click compatibele ncAA’s, SCO43 (strained alkyne) en azF (azide)44,45 (Fig. 1a). H148 en Q204 werden gekozen op basis van hun locatie op de vermeende dimeer interface (Fig. 1b en supplementaire Fig. 1). Beide residuen zijn bekend gemakkelijk worden gewijzigd met kleine molecule cyclooctyne adducten op azF incorporatie 34,46, en liggen dicht bij het functionele centrum, de sfGFP chromofoor (CRO) (Fig. 1b). Gel mobility shift analyse toonde aan dat de dimerisatie succesvol was (Fig. 1c, d); dit werd bevestigd door massaspectrometrie analyse (Supplementary Fig. 2). Residu 132 was niet voorspeld om op de dimeer interface (Fig. 1b en Supplementary 1) maar is bekend om compatibel te zijn met een reeks gespannen alkyne adducten variërend van kleurstoffen46 tot koolstof nanobuisjes35 tot single stranded DNA36. Dus, het fungeert als een goede test van ons vermogen om eiwit-eiwit interfaces en Click reactie compatibiliteit te voorspellen. Ondanks residu 132 wordt blootgesteld aan het oppervlak, werd geen dimer product waargenomen met behulp van sfGFP132azF met SCO bevattende eiwit (Supplementary Fig. 3) waaruit het belang van oppervlakte-interface compatibiliteit en het nut van in silico analyse in het helpen om klik chemie compatibele sites te identificeren. Ofwel sterische botsingen en / of eiwit-eiwit interacties die langer aanhouden op andere regio’s kunnen covalente verknoping op residu 132.

Positieve functionele schakelen op het vormen van sfGFP148x2 dimer

H148 vormt een H-bond met CRO (Fig. 1b) en speelt een belangrijke rol in proton shuttling die de populatie van de neutrale A (λmax ~ 400 nm, CRO A) en de anionische B vorm (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 regelt die aanwezig zijn in de grondtoestand. De B-vorm overheerst in sfGFP, maar op het incorporeren azF in plaats van H148 (sfGFP148azF) verwijdering van de H-bond resulteert in de A-staat nu overheersen33,34 (Fig. 2a en tabel 1). De incorporatie van SCO op residu 148 (sfGFP148SCO) geeft een soortgelijk effect, waarbij CRO A overheerst, maar met een kleinere rode verschuiving (λmax 492 nm) in de minder belangrijke CRO B vorm (Fig. 2a en Tabel 1).

Dimerisatie van sfGFP148azF en sfGFP148SCO produceert twee belangrijke positieve effecten: (i) schakelt fluorescentie bij ~490 nm door bevordering van de CRO B-vorm; (ii) sterk verbeterde helderheid door verhoogde molaire extinctiecoëfficiënt bij 490 nm (Fig. 2a en Tabel 1). De belangrijkste excitatiepiek is rood-verschoven bij dimerisatie (λmax 492 nm) in vergelijking met sfGFPWT (λmax 485 nm) (aanvullende tabel 3). De 490:400 nm extinctie verhouding verschuift met een orde van grootte van ~ 0,5 voor de monomeren tot ~ 5 voor het dimeer, met CRO B-vorm domineert het dimeer absorptiespectrum (Fig. 2a) ondanks de kennelijke afwezigheid van een soort die de rol van de H148 imidazoolgroep kan vervangen. Eerdere voorbeelden van het wijzigen van sfGFP148azF met kleine molecule adducten of foto-activering op zijn best resulteren in gedeeltelijke omzetting naar CRO B vorm 33,34. De 10-voudige schakelaar in absorptie wordt weerspiegeld in fluorescentie-emissie; excitatie bij 490 nm resulteert ~ 20-voudige hogere emissie dan een van beide monomeer (Fig. 2a). Bovendien vertoont het dimeer een verbeterde functie, zelfs in vergelijking met de oorspronkelijke superfolder sfGFPWT (Fig. 2b en Tabel 1). Molaire absorptie en helderheid verhoogd ~ 320% voor sfGFP148x2 (~ 160% op een per CRO basis) (Fig. 2b) hoger dan verwacht voor een eenvoudige additieve toename als monomeer eenheden handelen onafhankelijk van elkaar.

Om het belang van de biorthogonale link te onderzoeken construeerden we een klassieke disulfide-gebaseerde link door het muteren van H148 tot cysteïne. De sfGFPH148C varianten dimereerden maar alleen in aanwezigheid van Cu2+ (Supplementary Fig. 4). De spectrale eigenschappen suggereerden dat het dimeer minder fluorescent was in vergelijking met sfGFP148x2 en sfGFPWT (Supplementary Fig. 4). De sfGFPH148C monomeer weergegeven de verwachte schakelaar van CRO B tot CRO A. Terwijl een schakelaar van CRO A tot CRO B werd waargenomen op dimerisatie van sfGFPH148C, het dimeer had een lagere per CRO molaire absorptie dan sfGFPWT en aanzienlijk minder dan sfGFP148x2; een significante populatie van de A staat werd nog steeds waargenomen. De fluorescentie-emissie bij excitatie bij 490 nm voor het dimere sfGFPH148C was ongeveer de helft van die van sfGFPWT. Aldus genereerde de biorthogonale benadering een beter presterende dimere soort dan de klassieke disulfidebinding koppeling.

Moleculaire basis voor functionele omschakeling in sfGFP148x2

De kristalstructuur van sfGFP148x2 (zie aanvullende tabel 2 voor statistieken) laat zien dat de monomeren een uitgebreide dimer interface vormen met lange-afstand interacties die de twee CRO centra verbinden. De monomeer eenheden van sfGFP148x2 regelen in een quasi-symmetrische kop-staart opstelling verschoven met ~ 45 ° ten opzichte van elkaar (Fig. 3a). De antiparallelle zij-aan-zij monomeer rangschikking komt het dichtst bij die van het hoogst gerangschikte model (Supplementary Fig. 1 en Supplementary Table 1). De elektronendichtheid van de nieuwe triazoolverbinding is duidelijk gedefinieerd (Fig. 3b) en vormt de langgerekte anti-1,4-triazoolverbinding die gedeeltelijk begraven is en nauw geassocieerd is met beide monomere eenheden en zo een integraal onderdeel van het dimeerinterface vormt (Fig. 3c). De CRO’s liggen 15 Å uit elkaar en wijzen naar elkaar toe (fig. 3a).

De interface heeft vergelijkbare kenmerken als natuurlijke dimeren48. De oppervlakte van de interface is ~1300 Å2, waarbij over het algemeen dezelfde residuen van elk monomeer bijdragen (Fig. 3c, d). H-bindingen spelen een belangrijke rol met residuen E142, N146, S147, N149 en N170 van beide monomeren die bijdragen aan acht inter-subunit H-bindingen (Fig. 3b). De structuur toont aan dat natuurlijke dimer-interfaces kunnen worden nagebootst en gestabiliseerd door het gebruik van aan elkaar gekoppelde Click-monomeren, die volgens de oorspronkelijke modellering haalbaar waren, maar waarschijnlijk te zwak of van voorbijgaande aard waren om zonder de ingebedde koppeling te blijven bestaan. Het kan dus zijn dat onze benadering gebruikt kan worden om meer algemeen voorbijgaande zwakke eiwit-eiwit interacties te stabiliseren en zo gedefinieerde interfaces te vormen.

Dimerisatie induceert een reeks conformationele veranderingen om een lange-afstands interactienetwerk te vormen dat ten grondslag ligt aan het mechanisme waarmee sfGFP wordt ingeschakeld en de helderheid wordt versterkt. De sfGFP148azF structuur (PDB 5BT0)34 laat zien dat 148azF een vergelijkbare positie inneemt als H148 in sfGFPWT, maar niet de kritische H-binding kan aangaan met de CRO fenol OH groep die de vorming van de CRO B toestand bevordert. Bij dimeren leidt modificatie van 148azF door vorming van de triazoolverbinding met 148SCO in het cognaat-monomeer tot een verandering in zowel de backbone als de zijketenpositie, waardoor een gat ontstaat dat nu kan worden ingenomen door een watermolecuul in het dimeer (W1azF in fig. 4a). Het water kan een H-bond aangaan met CROazF en het carbonyl in de backbone van 148azF (fig. 4). Een equivalent water is aanwezig in de sfGFP148SCO monomeer eenheid, (W1SCO) die gelijkaardige interacties vormt. Deze gestructureerde watermoleculen kunnen de H-bond interactie vervangen die verloren gaat bij verwijdering van H148 en zo het dimeer activeren door de vorming van CRO B in de grondtoestand te bevorderen. De watermoleculen zijn ook begraven op het grensvlak van het dimeer, zodat de dynamische uitwisseling met het bulkoplosmiddel veel minder zal zijn. Bovendien zijn de twee CRO’s nu verbonden door een uitgebreid overwegend waternetwerk dat de dimeerinterface overspant (Fig. 4b, c). Analyse van de tunnelsamenstelling laat zien dat drie watermoleculen in elke eenheid (W1azF/SCO, W2azF/SCO en W3azF/SCO) symmetrisch zijn; W4 vormt samen met de ruggengraat van F145SCO de brug over het dimeerraakvlak om de twee waternetwerken met elkaar te verbinden. Aldus genereert dimerisatie een uitgebreid, inter-monomeer waterrijk H-bond netwerk, waardoor een overgang van de A-staat CRO naar de B-vorm wordt bevorderd.

Single molecuul fluorescentie-analyse van sfGFP148x2

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie werd gebruikt om het fluorescerende gedrag van sfGFP148x2 dimeren op het enkele molecuul niveau te onderzoeken. De fluorescentie intensiteit tijdsverloop van enkele sfGFP148x2 dimers aangetoond dat een reeks van intensiteit staten, met fluorescentie op ~ 80-100 telt overheerst en het weergeven van een langere levensduur dan de sub-populatie van hogere intensiteit staten, met deze gekenmerkt door korte uitstapjes naar een reeks van intensiteiten van ~ 100 tot 300 telt (Fig. 2c). De fluorescentie sporen tonen ook langdurige fotostabiliteit met lange perioden tot fotobleaching (Fig. 2c en aanvullende Fig. 5). In vergelijking, sfGFPWT fotobleaches sneller, met fluorescentie sporen met een enkele intensiteit staat waarin de op toestanden in het algemeen duren voor kortere perioden (Supplementary Fig. 6). Bovendien monomere sfGFPWT werd soms gevonden om te bestaan in een eerste donkere, niet-fluorescerende toestand, voorafgaand aan de initiatie van fluorescentie en de daaropvolgende fotobleaching (Supplementary Fig. 6). Extractie van de gemiddelde opeenvolgende fluorescentie ‘op tijd’ voorafgaand aan het fotobleken en de bezetting van voorbijgaande niet-fluorescerende staten (knipperen) vindt dat sfGFP148x2 langere perioden van continue fluorescentie (gemiddeld 0,9 s), in vergelijking met sfGFPWT (0,65 s) vertoont. Gezien de gelijkenis in gemeten enkel molecuul fluorescentie-intensiteit, de verhoogde ON tijden en fotobleaching levensduur waarschijnlijk bijdragen in de richting van de verhoogde fluorescentie waargenomen in steady state ensemble metingen van sfGFP148x2 (Fig. 2a).

In een poging om het bereik van fluorescentie toestanden waargenomen in de dimer sporen rationaliseren, werd een histogram van alle gemeten intensiteiten gegenereerd (Fig. 2c). In tegenstelling tot sfGFPWT (Supplementary Fig. 6) dat een enkele log-normale verdeling49 toont, sfGFP148x2 de voorkeur aan een twee-component fit50 (Fig. 2c). De gemeten intensiteit verdeling toont een overheersende lagere intensiteit piek (~ 90 telt) en een gedeeltelijk overlappende hogere intensiteit piek, als gevolg van de korte uitstapjes naar hogere intensiteit staten waargenomen in de enkele molecuul fluorescentie sporen. Hoewel een bimodale intensiteitsverdeling normaal gesproken verwacht zou kunnen worden in een dimeer dat bestaat uit twee naast elkaar geplaatste, onafhankelijk van elkaar actieve fluoroforen, waarbij elke fluorofoor opeenvolgend fotoblekt, zijn de tijdsverloopsporen van de intensiteit van één molecuul niet in overeenstemming met dit model en vertonen ze een gebrek aan twee goed gedefinieerde toestanden. Het eenvoudige aan/uit-gedrag van sfGFPWT wordt zelden waargenomen in de dimeer-sporen, die zelf niet de verwachte adductie van twee monomere sporen vertonen, maar een complexer gedrag.

Verhoogde functie bij het vormen van sfGFP204x2 dimer

Om te onderzoeken hoe verschillende koppelingsplaatsen functionele affecten kunnen uitlokken, onderzochten we het alternatieve dimeer sfGFP204x2 (Fig. 5a) dat hierboven werd geconstrueerd (Fig. 1d). We vonden dat dimerisatie de spectrale eigenschappen verbeterde boven die van eenvoudige toevoeging van de monomere of sfGFPWT eiwitten, wat opnieuw de synergetische voordelen van dimerisatie benadrukt. Incorporatie van azF of SCO op residu 204 had weinig effect op de spectrale eigenschappen in vergelijking met sfGFPWT 46 (Fig. 5b en Tabel 1). De B CRO-vorm overheerste in de monomere vormen; zowel de molaire extinctie als de emissie-intensiteit waren vergelijkbaar met elkaar en met sfGFPWT. De fluorescentie-emissie van sfGFP204SCO was lichtjes gereduceerd (80% van sfGFPWT; Tabel 1). Bij het vormen van de sfGFP204x2 dimer (zie Fig. 1d en supplementaire Fig. 2 voor bewijs) spectrale analyse toonde functionele verbetering in termen van de kern spectrale parameters: molaire extinctie coëfficiënt (ε) en fluorescentie-emissie (Fig. 5b en Tabel 1). Bij de dimerisatie nam ε tot 400% toe ten opzichte van de uitgangsmonomeren tot 160.000 M-1 cm-1. Dit komt overeen met een gemiddelde per CRO molaire extinctie van 80.000 M-1 cm-1, bijna een verdubbeling van de helderheid in vergelijking met de startmonomeren, en 31.000 M-1 cm-1 hoger in vergelijking met sfGFPWT. In overeenstemming met de verhoogde capaciteit om licht te absorberen, was ook de fluorescentie-emissie verhoogd; de genormaliseerde emissie per CRO was 180% hoger dan het sfGFP204azF monomeer. Met behulp van de Strickler-Berg51 berekening (website huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) fluorescentielooptijden dalen van 3,2 ns voor sfGFPWT tot 0,92 ns voor sfGFP204x2. Dus, net als bij sfGFP148x2 de dimerische structuur van sfGFP204x2 heeft een verhoogde kans op elektronische excitatie en fluorescentie-uitstoot in vergelijking met monomere vormen (zie Supplementary Fig. 8 voor spectrale vergelijking van dimers). Dit is des te indrukwekkender voor beide dimere vormen als sfGFPWT is een benchmark voor groene fluorescentie eiwit prestaties.

Het belang van symmetrie voor synergie

Natuurlijke eiwit homodimeren zijn over het algemeen symmetrisch1,52 en een dergelijke symmetrie werd nagebootst in onze kunstmatige dimer door middel van een gemeenschappelijke crosslink residu. Wij onderzochten het belang van een gemeenschappelijke crosslink residu (als nabootsing van structurele symmetrie) voor functionele synergie. Het voordeel van biorthogonale chemie is dat de onderling verenigbare reactiehandvatten de constructie van gedefinieerde paren mogelijk maken (d.w.z. 148 + 204 = 148-204 en niet 148-148 of 204-204), zodat wordt voorkomen dat ongewenste producten worden gevormd die moeilijk te scheiden zullen zijn.

Dimeren werden gegenereerd die residu 148 en 204 in de twee beschikbare combinaties (148SCO+204azF en 148azF+204SOC) aan elkaar koppelden. Steady state fluorescentie toonde aan dat in beide dimere vormen de geprotoneerde en gedeprotoneerde vormen van CRO duidelijk aanwezig waren (Fig. 6a, b). Het 148azF-204SCO gekoppelde dimeer vertoonde een verandering in de relatieve populaties van A- en B-vormen, met een aanzienlijke toename van de molaire extinctiecoëfficiënt bij 490 nm (Fig. 6a); deze was bijna het dubbele van de oorspronkelijke sfGFP204SCO en ~30% hoger dan voorspeld door eenvoudige optelling van de monomeer spectra. De relatieve hoogte van de 400 nm-piek blijft vergelijkbaar in zowel het sfGFP148azF- als het 148azF-204SCO-gekoppelde dimeer, wat suggereert dat de populatie van de gedeprotoneerde vorm in het dimeer vergelijkbaar is met die van het oorspronkelijke monomeer. Dimerisatie via de combinatie 148SCO-204azF veranderde de relatieve populaties van de geprotoneerde en gedeprotoneerde vormen, maar de vermindering van de 400 nm-absorptiepiek ging niet gepaard met een toename van de 490 nm-piek (fig. 6b). In feite was de dimerisatie zeer nadelig, aangezien beide grote absorptiepieken een lagere molaire absorptiecoëfficiënt hadden dan de eenvoudige additiespectra van de monomeren (fig. 6b). Het is duidelijk dat de asymmetrisch gekoppelde dimeren minder fluorescent zijn en een significante gemengde populatie van de twee CRO toestanden bevatten in vergelijking met de symmetrisch gekoppelde dimeren, zodat in dit geval de symmetrie belangrijke functionele implicaties heeft.

Heterodimeren en functionele integratie

Heterodimeren, waarbij een dimeer is samengesteld uit twee verschillende eiwitten, is een vaak waargenomen alternatieve dimerisatietoestand1,2. Het stelt ons ook in staat nieuwe complexen te ontwerpen waarin functioneel verschillende eiwitten kunnen worden gekoppeld. Het voordeel van bioorthogonale koppeling is de mogelijkheid om gedefinieerde, single species (hetero)dimeren te genereren die bestaan uit twee verschillende eiwiteenheden (d.w.z., A + B = A-B niet A-A, B-B, A-B mengsel dat moeilijk te scheiden kan zijn). De gele fluorescerende eiwit Venus29 werd gekozen als de partner eiwit om sfGFP, gezien de spectrale overlap tussen de twee (Supplementary Fig. 9). Sequence verschillen worden getoond in Supplementary Fig. 10.

SfGFP148SCO werd gecombineerd met de equivalente azF bevattende Venus (Venus148azF) tot GFVen148 genereren (zie Supplementary Fig. 11 voor bewijs). Nieuwe spectrale kenmerken ontstaan suggereren dat een geïntegreerd systeem is gegenereerd. Vorming van GFVen148 genereert een dimeer dat verbeterde helderheid in vergelijking met ofwel de sfGFP148SCO of Venus148azF (Fig. 7a en Supplementary Table 3) toont. Interessant is dat het dimeer heeft spectrale eigenschappen intermediair van individuele monomeren zonder significante piek verbreding (Fig. 7a, b en aanvullende Fig. 12a) suggereert dat de twee CRO centra functioneel geïntegreerd in termen van fluorescentie-emissie zijn geworden. De belangrijkste λmax is 505 nm, intermediair tussen sfGFP (492 nm) en Venus (517 nm). De ε equivalent aan de B CRO vorm (490-510 nm regio) neemt aanzienlijk toe (~4-5-voudig), hoger dan de eenvoudige additieve spectra van de monomeren, terwijl de A CRO populatie afneemt, maar nog steeds wordt waargenomen (Fig. 7a). Dit wordt geëvenaard door een ~ 4-voudige toename van de emissie-intensiteit bij excitatie bij 505 nm (Fig. 7b). Een enkele emissiepiek wordt waargenomen die ook intermediair is tussen de twee monomeren, ongeacht de excitatiegolflengte (λEM bij 517 nm; Fig. 7b, c); een enkele in plaats van een dubbele of verbrede piek werd waargenomen bij excitatie bij 490 nm (in staat om beide CRO’s op te wekken), wat suggereert dat een enkele soort uitzendt. Een additief spectrum van individuele monomeer spectra die twee onafhankelijk werkende eiwitten simuleert ondersteunt het idee van een nieuwe geïntegreerde functie als het is breder en rood-verschoven in vergelijking met de gemeten GFVen148x2 emissieprofiel (Supplementary Fig. 12b). Emissie bij excitatie bij 400 nm werd ook gemeten als Venus148azF heeft weinig absorptie bij deze golflengte in vergelijking met GFVen148. Emissie-intensiteit was 30-voudig hoger voor GFVen148 in vergelijking met monomere Venus148azF met emissie pieken bij 517 nm (Fig. 7c en Supplementary Fig. 12c). In plaats van het weergeven van klassieke FRET, zoals zou kunnen worden verwacht (vide supra), GFVen148 lijkt op te treden als een enkele entiteit in termen van fluorescentie-output. Dit zou erop kunnen wijzen dat twee CRO’s nu hoofdzakelijk als één soort optreden, waarbij de structurele aspecten die voor sfGFP148x2 werden waargenomen (zoals het waternetwerk) een rol spelen. De aanwezigheid van een significante neutrale A-toestand van de CRO suggereert dat de twee monomere eenheden niet volledig gesynchroniseerd zijn. Dit doet echter niets af aan de duidelijke impact die dimerisatie kan hebben op het ontstaan van nieuwe spectrale eigenschappen, zoals die in GFVen148.

Zoals bij sfGFP, had incorporatie van azF in plaats van Q204 (aangeduid als Venus204azF) weinig effect op de spectrale eigenschappen van Venus (supplementaire tabel 3). Covalente koppeling via 204 SPAAC (het maken van GFVen204) met succes gegenereerd een dimeer (Supplementaire Fig. 11). GFVen204 combineerde de spectrale eigenschappen van beide monomeren en genereerde een soort met λMax bij zowel 490 als 514 nm (verhouding van 1:1,2) (Fig. 7e, f en supplementaire tabel 3). Venus204 absorbeert ook bij 490 nm, maar in een verhouding van 1:2,7 tot 514 nm. Vorming van dimeren opnieuw versterkt molaire absorptie boven die van de individuele monomeren; met name ε verhoogd met ~ 26.000 M-1 cm-1 (~ 27%) voor de Venus geassocieerde λmax (514 nm) waar er weinig bijdrage voor sfGFP. Om de communicatie tussen de monomeren te onderzoeken, werd de fluorescentie-emissie bij excitatie op vier verschillende golflengten gecontroleerd: 400 nm (alleen sfGFP); 450 nm (sfGFP, minor Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venus schouder); 510 (Venus, minor sfGFP). Bij alle excitatie-golflengten was de enige duidelijke emissiepiek bij 528 nm (Fig. 7b), die overeenkomt met Venus die wijst op communicatie door Förster resonantie energieoverdracht (FRET). Een emissiepiek correlerend met sfGFP204SCO (~510 nm) werd niet waargenomen, zelfs niet bij excitatie bij de lagere golflengtes specifiek voor sfGFP. Evenmin werd de intermediaire emissiepiek die kenmerkend is voor GFVen148 waargenomen, wat de nieuwe kenmerken van het 148 heterodimeer onderstreept. Het meest significante verschil werd waargenomen bij excitatie bij 400 nm, waar er een 14-voudige toename is in emissie-intensiteit bij 528 nm voor GFVen204 vergeleken met Venus204azF (Fig. 7f, inzet). De berekende relatieve FRET-efficiëntie na spectrale ontleding was ongeveer 90%. De twee functionele centra communiceren dus via energieoverdracht (Fig. 7g) op een zeer efficiënte manier.